Методы защиты человека от воздействия приоритетных поллютантов (стр. 40 )

Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом

Ферментативное определение триацилглицеридов протекает в несколько стадий. На первой стадии триглицериды гидролизуются до глицерина и жирных кислот с помощью специально подобранных липаз:

Триглицериды + Н2О – липаза  глицерин + жирные кислоты

На второй стадии под действием глицерокиназы происходит фосфорилирование глицерина:

Глицерин + АТФ –глицерокиназа  глицерол – 3 фосфат + АДФ

На конечной стадии процесса образуется окрашенное соединение хинонимин. Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе.

Глицерол – 3 фосфат + О2 – ГФО  дигидроксиацетон фосфат + 2Н2О2

Н2О2 + 4-ААР + 4 – хлорфенол – пероксидаза  хинонимин + 4Н2О

В качестве исследуемого материала необходимо использовать сыворотку крови без следов гемолиза. 200 мкл свежей сыворотки крови добавить к рабочему реагенту, объемом 2 мл.

Рабочий реагент содержит стандартный раствор ХС с концентрацией 45 ммоль/л, хлорид магния 5 ммоль/л, 4-хлорфенол 6 ммоль/л, липазу > 100 Ед/мл, глицерокиназу > 1,5 Ед/мл, глицерол-3-фосфатоксидазу > 4 Ед/мл, пероксидазу > 0,8 Ед/мл, 4-Аминоантипирин (4-ААР) 0,75 ммоль/л, АТФ 0,9 ммоль/л; с рН = 7,0.

Калибровочная и контрольная пробы готовятся прибавлением 200 мкл калибратора или дистиллированной воды к 2 мл рабочего реагента. Пробы необходимо перемешать и инкубировать при температуре 370С в течение 10 минут. Оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы измеряют в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1см при длине волны 500 нм. Расчет содержания триглицеридов в исследуемом образце проводили по формуле:,ммоль/л

Результаты анализа интерпретировать в соответствии с величинами, рекомендованными ВОЗ.

Критерии оценки:  нормальные показатели – 0,15 – 1,71 ммоль/л или 13 – 160 мг/100 мл, группа риска – 1,71 – 2,29 ммоль/л или 160 – 200 мг/100 мл, патологические показатели > 2,29 ммоль/л или 200 мг/100 мл.

Определение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови прямым методом

Измерения концентрации ЛПВП необходимо проводить с использованием термостатируемой кюветы при постоянной температуре 370С. Сыворотку в количестве 6 мкл нужно добавить к рабочему реагенту Й объемом 750 мкл. Калибровочную пробу готовят прибавлением 6 мкл калибратора к 750 мкл реагента. Рабочий реагент должен содержать: буфер Гуда 35 ммоль/л, холестеролэстеразу ≥ 0,8 Ед/мл, холестеролоксидазу ≥ 0,5 Ед/мл, 4-аминоантипирин (4-ААР) 0,5 ммоль/л.

Пробы необходимо перемешать, кювету поместить в фотометр и инкубировать в течение 5 минут при температуре 370С. По окончании инкубации определить адсорбцию А1 при 500 нм против дистиллированной воды. Далее добавить к исследуемым образцам и калибратору 250 мкл реагента ЙЙ, содержащего 35 ммоль/л буфера Гуда, пероксидазу ≥ 1 Ед/мл и 2,4,6-трибромо-3-гидроксибензойную кислоту (ТВНВ) 0,42 г/л. Через 5 минут измерить адсорбцию А2.

Расчет содержания холестерина ЛПВП в исследуемом образце проводят в соответствии с формулой:, (ммоль/л)

Принцип метода заключается в том, что под действием полимера и детергента холестерин из липопротеинов высокой плотности (но не из липопротеинов низкой плотности, очень низкой плотности и хиломикрон) образца переходит в растворенное состояние. с участием сопряженных реакций, описанных ниже.

Эфиры холестерина + Н2О – холестеролэстераза  холестерин + ЖК

Холестерин + О2 – холестеролоксидаза  холест-4-ен-3-ен-он + Н2О2

2Н2О2 +4-ААР+ ТВНВ+ пероксидаза  хинониминовый краситель + 4Н2О

Критерии оценки:  нормальные показатели для мужчин > 1,42 ммоль/л (55 мг/100 мл), для женщин > 1,68 ммоль/л (65 мг/100 мл), группа риска – мужчины – 0,9 – 1,42 ммоль/л (35 – 55 мг/100 мл), женщины – 1,16 – 1,68 ммоль/л (45 – 65 мг/100 мл), патология – мужчины < 0,9 ммоль/л (36 мг/100 мл), женщины < 1,16 ммоль/л (45 мг/100 мл).

Определение концентрации холестерина липопротеинов очень низкой плотности и холестерина липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови

Уровень ЛПОНП рассчитывается по формуле:

ХС ЛПОНП (ммоль/л) = Триглицериды / 2,2

Уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) рассчитывается исходя из уровня общего холестерина, триглицеридов и ХС ЛПВП. по формуле Фридвальда: ХС ЛПНП (ммоль/л) = ОХ – Триглицериды/ 2,2 – ХС ЛПВП

Критерии оценки: нормальные показатели для ЛПНП ≥ 3,9 ммоль/л (150 мг/100 мл), патология ≥ 4,9 ммоль/л (190 мг/100 мл).

Отражением дислипопротеинемии может служить коэффициент атерогенности. Коэффициент атерогенности, иначе индекс атерогенности, является характеристикой атерогенной направленности липидного спектра. Индекс атерогенности рассчитывается как отношение содержания ХС в ЛПНП и ЛПОНП к его содержанию в ЛПВП.

  ХС общий – ХС ЛПВП

  ХС ЛПВП

Критерии оценки  ИА: в норме этот показатель колеблется в пределах 1,98 – 2,51, при величине ИА=3 имеется умеренная вероятность развития ИБС, при величине более 3 – высокая вероятность ИБС.

3.1.5 Определение активности  г - глютамилтрансферазы

Активность г-глютамилтрансферазы в сыворотке  крови определяется на основании кинетической реакции с L-г-глютамил-3-карбокси-4-нитроанилидом. Скорость образования 5-амино-2-нитробензоата измеряемая колориметрически прямо пропорциональна активности г-глютамилтрансферазы.

В кювету поместить1000 мкл рабочего реактива, подогреть до температуры определения, затем добавить: 100 мкл исследуемого материала. Тщательно перемешать, инкубировать в указанной температуре. По истечении 1 минуты определить коэффициент поглощения относительно воздуха или дистиллированной воды. Повторить измерение после очередных 1, 2, 3 минут. Определить среднее изменение коэффициента поглощения за минуту (А/мин).

Для расчёта результатов использовать формулу:

активность GGT [Ед/л] = A/мин. x 1158

За 1 Ед/л принимают  0,0167 мккат/л

Критерии оценки активности ГГТ:

активность фермента в норме для мужчин-7-32 Ед/л, для женщин - 11-50 Ед/л.

3.2. Оценка эффективности использования оптимальных методов защиты человека от воздействия приоритетных поллютантов на примере Оренбургской области

Для оценки эффективности комбинированных методов сочетающих антиоксидантный эффект витаминотерапии и адаптационное воздействие гипоксической терапии в условиях Оренбургской области с учетом особенностей экологического состояния региона была разработана программа профилактики и коррекции действия приоритетных поллютантов на организм человека.

Программа включает четыре блока (схема 1).

Схема 1

Индикаторы, позволяющие оценить эффективность методов, определяются до и на фоне витаминотерапии, а также до и после гипоксической тренировки и включают:

оценку свободнорадикального окисления липидов в цельной сыворотке крови п оценку свободнорадикального окисления липидов в суммарной фракции апо-В ЛП (ЛПНП и ЛПОНП) сыворотки крови; определение содержания витаминов антиоксидантов (А и Е) в сыворотке крови; определение содержания витамина С в моче; анализ активности основных ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы и каталазы) – в гемолизатах эритроцитов; определение показателей липидного спектра; определение органоспецифичных ферментов сыворотки крови (АлСТ, АсЛТ, ГГТ) и мочевой кислоты (МК)

Для программы профилактики и коррекции действия приоритетных поллютантов на организм человека, а также дальнейшей оценки эффективности внедряемых методов, определенных в процессе проведения I-го этапа исследований из всей когорты обследованных лиц были сформированы группы: группа вмешательства и группа невмешательства (контрольная). Группы были сопоставимы по полу и возрасту и образу жизни, у лиц, включенных в группы, не было выявлено хронических заболеваний.

Каждая группа вмешательства была разделена на две подгруппы (схема 2). Первая группа 1-я подгруппа (обучающаяся молодежь n=50) получила 2 профилактических курса витаминотерапии препаратом «Селмевит»; в перерывах между курсами круглогодичной профилактики препаратом «Компливит» (Фармстандарт, Россия). Вторая подгруппа (обучающаяся молодежь n=50) получила те же курсы витаминопрофилактики, но в сочетании с курсом периодической нормобарической гипоксии. Для коррекционной группы вмешательства был проведен коррекционный курс витаминотерапии, для первой подгруппы (работающее население n=50) – курс самостоятельного приема витаминов, для второй подгруппы (работающее население n=50) – прием витаминов в сочетании с гипокситерапией.

                                                                               Схема 2.

При формировании групп критериями исключения служили:

1. Отказ пациентов участвовать в исследовании.

2. Нарушения функции печени с повышенным уровнем ACT и/или АЛТ>2.

3. Гиперчувствительность к препарату к компонентам витаминных комплексов;

4. Наличие сведений о наркомании или алкоголизме в анамнезе на протяжении последнего года.

5. Беременность, кормление грудью.

Первичный осмотр обследуемых и динамическое наблюдение за ними в процессе лечения осуществлялось  врачом-терапевтом.

Все обследуемые проходили курс адаптации к периодической нормобарической гипоксии (ПНГ) с общеоздоровительной целью. В течение всего периода адаптационной терапии они находились на амбулаторном режиме. Перед началом лечения и после его окончания все проходили комплексное обследование, которое включало осмотр врача-терапевта, общий анализ мочи и крови, записи ЭКГ, вариационную пульсометрию, биохимический анализ крови.