Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана–бетулоновой кислотой и ее производными. 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология; 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук (стр. 6 )

Таблица 10. Изменения показателей лейкоцитарной формулы на 4-й и 14-й дни опыта после введения БК и β-алаБК на фоне доксорубицина (M±m)
Группа	Эозинофилы	Палочкоядерные	Сегментоядерные	Моноциты	Лимфоциты
День	4	14	4	14	4	14	4	14	4	14
Контроль	2±1,2	1,7±0,9	0±0	0±0	22,7±6,3	20±1,5	7,3±2,3	7±2	68±7,0	71,3±4,4
ДОК	1±0,5	1±1	0,4±0,2	0±0	35,2±7,4	35,6±9,2	8,0±2,1	9,6±1,7	55,4±8,66	53,8±8,7
ДОК+БК	0,7±0,5	0,6±0,2	0,2±0,2	0±0	32,2±8,4	26,8±6,12	8,8±1,3	7,8±1,6	58,3±7,87	64,8±7,3
ДОК+ β-алаБК	0,3±0,2	0,5±0,3	0±0	0,2±0,2	28,7±4,1	28,2±7,3	11,6±0,7	8,5±1,6	58,83±3,61	56±8,5
БК	1±0,7	0,6±0,2	0±0	0±0	19±2,2	21,4±3,5	11,6±1,1	11±2,3	68,2±3,12	67±4,9
β-алаБК	1,6±0,6	0,4±0,3	0±0	0±0	20±4,2	26,4±4,1	10±0,7	12,2±1,1*	68,2±4,51	61±3,9
Примечание. * - р<0,05, относительно контроля.

Полученные результаты показали, что введение цитостатика в дозе 7 мг/кг не оказывает существенного патологического влияния на картину периферической крови. Введение ДОК вызвало лишь изменение со стороны белой крови в виде достоверного лейкоцитоза к 14-м суткам наблюдения. При этом соотношение форменных элементов в лейкоцитарной формуле не отличалось от контроля. Тем не менее, БК и β-алаБК на фоне ДОК проявили тенденцию к нормализации показателей белой крови, что коррелировало с результатами, полученными в опыте с ЦФ. Отмеченные выше сдвиги в белой крови под действием ДОК согласуются с литературными данными об абортивном увеличении зрелых форм нейтрофилов в костном мозге к 4 – 7-м суткам после введения препарата в максимально переносимой дозе ( и др., 1999).

Описанные в литературе механизмы коррекции функций лимфоидных органов после воздействия ЦФ и ДОК в целом одинаковы и связаны с ролью Т-лимфоцитов в восстановлении костномозгового и селезеночного кроветворения. В представленной работе характер и степень выявленного гематотоксического эффекта ДОК определялись величиной введенной дозы, которая составляла половину от максимально переносимой. В этих условиях не удалось достичь значимого токсического действия цитостатика на кроветворную систему и, соответственно, выявить корректорное действие лупановых агентов. Однако в данном случае, так же как и в опыте с ЦФ, наблюдалась тенденция к нормализации лейкоцитов крови и массы тимуса при сочетанном введении ДОК и тритерпеноидов, свидетельствующая о иммунопротекторном действии БК и ее аланиламида.

Морфологические изменения печени. Повреждения печени после введения ДОК проявлялись в виде умеренной жировой дистрофии гепатоцитов (преимущественно мелкокапельной) и значительных литических изменениях цитоплазмы («опустошении» цитоплазмы, как правило, это был лизис больших скоплений гликогена). Гемодинамические нарушения, проявлявшиеся в ранние сроки эксперимента полнокровием и окклюзией синусоидов (многие сосуды были заполнены плазмой), усиливались к 14-м суткам наблюдения. К концу эксперимента в печени развивался венозный застой, который был также следствием гемодинамических нарушений в большом круге кровообращения. На этом фоне регистрировались преимущественно перицентральные некрозы гепатоцитов и инфильтрация очагов некроза мононуклеарными клетками в основном лимфоидного ряда.

Наблюдалось также нарушение поглотительной, накопительной и экскреторной функции гепатоцитов, ультраструктурными маркерами этих изменений были снижение количества эндоцитозных/пиноцитозных везикул и числа микроворсинок плоть до сглаживания поверхности гепатоцитов на синусоидальном полюсе и спавшиеся диктиососмы комплекса Гольджи. В то же время в других гепатоцитах отмечалось увеличение площади синусоидальной поверхности за счет сокращения латеральной поверхности и образования микроворсинок, отражающего усиление трансмембранного обмена.

Ультраструктурный анализ синусоидальной выстилки и пространства Диссе показал, что токсическое действие ДОК вызывало окклюзию микрососудов и синусоидных капилляров печени клетками крови. В пространство Диссе мигрировали многочисленные клетки лимфо - и моноцитарного ряда, плазмоциты разной функциональной активности. Наблюдалось значительное расширение синусоидов, заполненных гипертрофированными макрофагами (клетками Купфера). При этом свободный (полезный) просвет синусоидов сужался; во многих синусоидах наблюдался некроз эндотелиальных клеток.

Следует особо подчеркнуть, что в данной модели доксорубицинового повреждения печени не отмечалось развитие перицеллюлярного фиброза во все сроки эксперимента, звездчатые клетки встречались очень редко. Основной клеточной популяцией среди соединительнотканных клеток были клетки Купфера, которые часто содержали гетерогенные липидные включения. К 14-м суткам в синусоидах появлялись сегментоядерные нейтрофилы, активированные плазмоциты с хорошо развитой цитоплазматической сетью и активные формы клеток Купфера с обилием лизосом, фагосом и остаточных телец. Миграция нейтрофилов в печень в эти сроки была связана с некрозами гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ДОК с последующим введением БК и ее амида морфологические изменения печени были сходными. Отмечались умеренная субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, некроз отдельных гепатоцитов, венозное и синусоидальное полнокровие, более выраженное при применении амида БК. В обоих случаях отмечалась умеренная миграция моноцитов (в основном клеток Купфера) в перисинусоидальные пространства. Через 14 сут после введения ДОК и БК сохранялась субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, в которых при этом отмечались массивные накопления гликогена. После применения ДОК и амида БК липидная инфильтрация гепатоцитов была более выраженной (по характеру как мелко-, так и крупнокапельная), при этом отложения гликогена были менее значительными, чем после применения БК. При использовании обоих тритерпеноидов регистрировалось неравномерное полнокровие сосудов. В этот срок эксперимента усиливалась мононуклеарная инфильтрация печеночной дольки.

Ультраструктурные изменения гепатоцитов через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК и ее амида заключались в усилении секвестрации гликогена, частичной деструкции митохондриальных крист и усилении аутофагоцитоза. Через 14 сут подобные изменения регистрировались в отдельных гепатоцитах. Следует отметить, что при сочетанном применении ДОК и тритерпеноидов так же, как и в случае с ЦФ, усиливалась эндоцитозная активность гепатоцитов, отмечалась гипертрофия и гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи. Синусоидные капилляры во все сроки эксперимента были обтурированы мононуклеарами и клеточным детритом.

Морфологические изменения миокарда после введения ДОК были более значительными при сравнении с ЦФ. Через 3 сут после введения ДОК отмечались литические изменения саркоплазмы и ультраструктур кардиомиоцитов. Литические изменения миофибрилл при доксорубициновом повреждении чаще носили диффузный характер. В изменениях ядрышек чаще манифестировали явления сегрегации фибриллярного и гранулярного компонентов нуклеолонемы. Практически во всех кардиомиоцитах наблюдались расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. В то же время изменения митохондриального компартмента были незначительными и заключались в основном в неравномерном расширении крист. Важно отметить, что при доксорубициновых, как и при циклофосфановых повреждениях кардиомиоцитов, в очагах лизиса миофибрилл в этот срок эксперимента всегда регистрировались полисомы и наблюдались хаотично расположенные новообразованные миофиламенты, что свидетельствовало об активации процессов внутриклеточной регенерации.

Через 14 сут после однократного введения крысам ДОК литические и деструктивные изменения отдельных кардиомиоцитов усиливались (выявлялись очаговые и диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и расширенные везикулы агранулярной саркоплазматической сети). В этот срок эксперимента манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства, отмечались явления аутофагоцитоза (особенно в околоядерной зоне).

В группе крыс, получавших ДОК и в последующем БК или ее амид, ультраструктурные изменения кардиомиоцитов были более выраженными, чем в аналогичных группах с циклофосфановыми повреждениями. Через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК во многих кардиомиоцитах выявлялись значительные диффузные литические повреждения миофибриллярных пучков и саркоплазматического матрикса, в результате чего саркоплазма клеток выглядела разреженной. Манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства и саркоплазматической сети. Во многих кардиомиоцитах эти изменения были даже более выраженными, чем при введении только ДОК. К 14-м суткам общий характер изменений кардиомиоцитов сохранялся, но значительно уменьшалась выраженность литических изменений миофибриллярных пучков, отмечалось более компактное расположение органелл в клетках. Одновременно в некоторых клетках наблюдались значительные вакуолеобразные расширения межмембранного околоядерного пространства, в которых часто регистрировались мембранозные образования. Следует также отметить, что в кардиомиоцитах часто встречались единичные митохондрии со значительным лизисом матрикса и выраженной редукцией крист.

В кардиомиоцитах крыс, получавших ДОК и в последующем амид БК, через 3 сут эксперимента также регистрировался весь спектр отмеченных выше ультраструктурных изменений: диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и митохондриального компартмента, расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. Отмечался выраженный полиморфизм ядер, в которых содержались фрагментированные и сегрегированные ядрышки. В саркоплазме кардиомиоцитов наблюдалось большое количество равномерно распределенных полисом. Через 14 сут в кардиомиоцитах значительно снижалась выраженность литических изменений миофибрилл и митохондрий; реже встречались клетки с расширенным межмембранным околоядерным пространством. Регистрировался полиморфизм ядер кардиомиоцитов, в которых содержались фрагментированные ядрышки или ядрышки с преимущественно гранулярным компонентом.

В миокарде при введении ДОК и тритерпеноидов в первые 3 сут отмечен их синергизм с цитостатиком в отношении выраженности ультраструктурных изменений основных компартментов кардиомиоцитов, но без длительного подавления процессов внутриклеточной регенерации и более быстрым восстановлением тонкой структуры клеток. Участие амида БК в стимуляции регенераторных резервов клеток показано на примере восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов после однократного введения ЦФ ( и др., 2007, 2008). При этом для амида БК характерны более выраженные изменения ультраструктуры митохондрий, чем для БК. Выраженные изменения ультраструктуры митохондрий под действием амида БК косвенно свидетельствуют о возможной активации проапоптотических факторов, обеспечивающих внутренний митохондриальный механизм клеточной смерти, который является ведущим механизмом для тритерпеноидных соединений.

Полученные нами данные косвенно указывают на наличие у амида БК апоптоз-индуцирующей активности, что, вероятно, связано с его противоопухолевым действием. Важнейшей особенностью действия амида БК, выявленного нами в условиях цитостатического воздействии, является активация им репаративных сигнальных путей, с которыми связана стимуляция пластических резервов клетки. Признаками такой стимуляции были повышение на фоне сочетанного введения амида и ЦФ регенераторного резерва печени и сердца в виде увеличения пула двуядерных гепатоцитов и одноядерных кардиомиоцитов, а также более быстрое восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов на фоне ДОК. Протекторное действие БК в условиях цитотоксического воздействия ЦФ менее выражено, оно проявилось лишь в виде стимулирующего влияния на гранулоцитарный росток крови. БК в меньшей степени, чем ее амид, снижала некрозогенное действие ЦФ в печеночной паренхиме, а также демонстрировала большую выраженность литических повреждений миофибрилл кардиомиоцитов на фоне ДОК.

Установлено, что вызываемая тритерпеноидами олеонанового типа (CDDO CDDO-Me) митохондриальная дисфункция предшествует гибели опухолевых клеток путем аутофагии (Samudio I. еt al., 2008). При этом в клетках клонированной хронической миелоидной лейкемии с помощью трансмиссионной электронной микроскопии было выявлено интенсивное образование везикул, окруженных двойной мембраной. Кроме того, иммуногистохимическими методами было обнаружено увеличение окрашивания белка LC3B, обычно связанного с аутофагосомами. Развитию аутофагии предшествовало резкое увеличение реактивных кислородных частиц, истощение пула внутриклеточного глутатиона и уменьшение потребления клетками кислорода. Причем если в субтоксических дозах тритерпеноиды нарушают процессы дыхания в опухолевых клетках, то в токсических вызывают быстрое падение митохондриального потенциала, окислительный стресс и гибель в результате апоптоза или аутофагии.

Исследование коррекции бетулоновой кислотой и ее производными

цитотоксических эффектов комбинированного введения цитостатиков

по схеме СНОР у интактных животных

В данной серии экспериментов изучались корректорные свойства БК и двух ее аланиламидных производных (β-алаБК и Ме-β-алаБК).

Исследование морфологической картины периферической крови после введение крысам комплекса химиотерапевтических препаратов (ПХТ) выявило угнетение эритроцитарного и лейкоцитарного ростка. К 5-м суткам после цитостатического воздействия количество лейкоцитов крови снизилось на 42% и удерживалось на этом уровне в течение 10 дней. Уменьшение числа циркулирующих эритроцитов было небольшим 6-9%. Содержание тромбоцитов в циркулирующей крови достоверно не отличалось от контроля во всех группах с ПХТ. Введение БК на фоне ПХТ не оказало заметного корригирующего влияния на численность клеток белой крови. Ее аланинамидные производные, напротив, задержали развитие лейкопении и несколько снизили ее тяжесть. Так в группе с введением β-алаБК количество лейкоцитов в крови на 5-й день после ПХТ уменьшилось на 28%, а в группе с его эфирным аналогом на 10-й день опыта – на 15%. В конце постцитостатического периода содержание эритроцитов и лейкоцитов в группах с введением аланинамидных производных оставалось ниже нормы, бетулоновая кислота повысила лишь уровень красных кровяных клеток. Показатели гемоглобина во всех группах коррелировали с количеством эритроцитов. Уменьшение гематокрита в первые 10 дней после ПХТ было связано с падением клеточности крови в этот период.

В результате анализа лейкоцитарной формулы, установлено достоверное снижение лимфоцитов в ответ на ПХТ (на 14 – 22% относительно контроля), сохранявшееся на протяжении всего постцитостатического периода. Введение БК и ее производных не оказало заметного влияния на выраженность лимфопении, однако Ме-β-алаБК в первые 5 дней после ПХТ частично купировал этот эффект, повысив уровень лимфоцитов на 6%. Кроме того, тритерпеноиды оказали корригирующий эффект в отношении моноцитоза, развившегося под влиянием цитостатиков. В первые 5 дней после ПХТ в группах с введением БК и Ме-β-алаБК количество моноцитов оставалось в норме, в то время как в группе с изолированным введением цитостатиков их уровень повысился в 1,6 раза. В конце постцитостатического периода отмечена тенденция к более быстрому восстановлению содержания моноцитов в крови под действием всех тритерпеноидов.

На фоне вызванной цитостатиками лимфопении у крыс наблюдалось достоверное увеличение сегментоядерных нейтрофилов (максимально в 2,0 раза на 10-й день после ПХТ). В конце цитостатического периода данный показатель снижался, однако оставался в 1,5 раза выше по сравнению с контролем. Введение БК и ее аланинамидных производных не оказало заметного корригирующего влияния на выраженность нейтрофилеза, вызванного ПХТ. Тритерпеноиды также не влияли на уровень эозинофилов в крови, превысивший норму во всех группах с ПХТ в конце постцитостатического периода.

Следует отметить, что в конце постцитостатического периода во всех опытных группах и в референсной группе с ПХТ наблюдалось постепенное восстановление показателей периферической крови и различия между группами уменьшались. Так на 14-й день введения тритерпеноидов на фоне ПХТ, их влияние выражалось в небольшом подъеме эозинофилов и уменьшении моноцитоза, в то время как количество нейтрофилов и лимфоцитов в основном соответствовала показателям референсной группы.

Таким образом, корректорный эффект тритерпеноидов в условиях ПХТ выражался в ослаблении ее угнетающего эффекта на лейкоцитарный росток крови в раннем постцитостатическом периоде. При этом регулирующее влияние агентов было направлено преимущественно на моноциты, а не гранулоциты.

Анализ препаратов костного мозга через 15 дней после цитостатического воздействия показал, что во всех группах с ПХТ в целом происходит восстановление костномозгового кроветворения. Содержание стромальных и миелоидных клеток у крыс не выходило за пределы аналогичных показателей в контроле. Соотношение предшественников и зрелых миелоцитов (индекс созревания) соответствовало норме. Вместе с тем, в костном мозге крыс с изолированным введением цитостатиков отмечалось увеличение количества эозинофильных и моноцитарных клеток (в 1,3 и 1,7 раз относительно контроля). В группах с введением БК и b-алаБК происходила коррекция этих элементов до уровня контроля. Эфир амида подобным эффектом не обладали. Аланинамидные производные БК нормализовали также количество плазматических клеток, которое возрастало после введения цитостатиков. Состояние гемопоэтических предшественников эритроцитов и тромбоцитов свидетельствовало о завершении восстановительного периода эритро - и мегакариоцитопоэза через 15 дней после ПХТ. Достоверно не отличалось от контроля и количество костномозговых лимфоцитов у всех животных после ПХТ, хотя содержание эритроцитов и лимфоцитов в циркулирующей крови в эти сроки еще не достигало нормы.

Данные анализа костного мозга свидетельствуют о более ранней нормализации основных клеточных элементов под действием тритерпеноидов с преимущественным влиянием на клетки моноцитарного ряда.

Отмеченные ранее особенности корректорного действия тритерпеноидов в опытах с циклофосфаном и доксорубицином проявились также на фоне экспериментальной химиотерапии по схеме СНОР. В частности, выявленный тимус-протекторный эффект агентов подтвердился в результате морфологического исследования ткани этого лимфоидного органа. Показано, что через 15 дней после цитостатического воздействия в тимусе наблюдается мелкоочаговая гипоплазия лимфоидной ткани, которая проявлялась в виде относительного снижения плотности его лимфоклеточной популяции, сужения корковой части, увеличения числа телец Гассаля в мозговом веществе (табл. 11).

По литературным данным, в результате воздействия противоопухолевых препаратов наступает дезорганизация тимуса, которая характеризуется истончением коркового вещества, инверсией окраски коркового и мозгового слоев и сопровождается сокращением массы тимуса. При этом количество Thy1,2+ в костном мозге животных резко сокращается ( и др., 1999). В нашем эксперименте под влиянием СНОР корково-мозговой индекс снизился в 1,6 раз относительно контроля. Это указывает на уменьшение поступления из костного мозга в корковую зону тимуса низкодифференцированных лимфоцитов, что может являться следствием как угнетения костномозгового кроветворения, так и гипоплазии самого тимуса. Последнее предположение подтверждается данными морфологического анализа, выявившим увеличение числа телец Гассаля, которые являются продуктами дегенерации медулярных клеток тимуса и содержат в основном кератины. Введение тритерпеноидных агентов на фоне СНОР привело к повышению корково-мозгового индекса и снижению количества телец Гассаля в паренхиме тимуса. Наиболее выраженный тимус-протекторный эффект проявил b-алаБК, увеличивший тимический индекс в 1,8 и снизивший число телец Гассаля в 2,2 раза. Соответствующее корректорное действие его метилового эфира и самой БК проявилось слабее (см. табл. 11).

Таблица 11. Влияние БК и ее β-аланиламидных производных на морфометрические показатели ткани тимуса крыс в постцитостатическом периоде
Группа	Объемная плотность, Vv %	Индекс К/М	Количество телец Гассаля
К	М
Контроль	64,61±1,02	35,56±1,03	1,97±0,10	3,37±0,23
ПХТ	55,62±1,03*	43,41±1,00	1,22±0,06*	7,16±0,26*
ПХТ+БК	60,32±1,03	39,68±1,03	1,55±0,06	5,05±0,18
ПХТ+β-алаБК	68,58±0,68#	31,42±0,68#	2,22±0,07#	3,28±0,12#
ПХТ+ Ме-β-алаБК	57,83±0,88*	43,24±1,04*	1,4±0,05	6,04±0,18*
Примечание. К – кора; М - мозговое вещество. * - р<0,05 в сравнении с контролем; # - р<0,05 в сравнении с ПХТ.

Морфологическое исследование почек, проведенное через 15 дней после введения комплекса цитостатиков, выявило развитие альтеративных процессов, как в паренхиме, так и клубочках. На гистологических срезах наблюдалось полнокровие сосудов, отек интерстиция, расширение мезангия, сужение просвета капсулы Шумлянского-Боумена, дистрофические и атрофические изменения эпителиоцитов канальцев. На всем протяжении канальцевой системы, в том числе и в собирательных трубочках, расширенный просвет был заполнен белково-клеточными массами, встречались гиалиновые цилиндры.