Модуляция активности транскрипционных регуляторов p53 и NF-kB в условиях микоплазменной инфекции как фактор, способствующий трансформации эукариотических клеток и опухолевой прогрессии (стр. 7 )

Работа выполнена совместно с к. б.н. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России].

Активация NF-KB ассоциирована с подавлением транскрипционной активности р53.

Проведенные нами исследования показали, что микоплазменная инфекция способна модулировать активность двух важных транскрипционных факторов р53 и NF-kB клетки-хозяина, изменяя тем самым целый ряд клеточных реакций. Исходя из существующих данных об антагонизме двух этих факторов (p53 и NF-kB) у нас возникло предположение, что активация транскрипционного фактора NF-kB в клетках через TLR2-сигнальный путь может быть сопряжена с подавлением активности р53. Для проверки этого предположения нами методом лентивирусной трансфекции были получены клетки на основе линии MCF-7, которые, одновременно, несут р53- и NF-kB-респонсивные элементы. При этом под контролем р53-респонсивного элемента находится ген b-галактозидазы, а под контролем NF-kB-зависимого промотера ген люциферазы. Кроме этого, как было показано ранее (см. Рисунок) данные клетки экспрессируют специфические Толл-подобные рецепторы для диациллипопептидов микоплазм.

Для того, чтобы исключить сложные воздействия, которые могут быть связаны с микоплазменной инфекцией, в эксперименте для активации NF-kB использовались только диациллипопептиды (R-Pam2). Эксперимент проводился по следующей схеме. Клетки MCF-7 обрабатывали разными концентрациями цисплатины, через 2 часа к обработанным клеткам добавляли R-Pam2 концентрации 1 мкг/мл. Через 18 часов проводилось определение уровня активности NF-kB и р53. Из представленных на рисунке 42 результатов видно, что добавление R-Pam2 вызывало мощную активацию NF-kB в клетках MCF-7. При этом повышение активности NF-kB, как и предполагалось, было ассоциировано с достоверным снижением активности р53 (р<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты позволили сделать заключение о том, что подавление активности р53 в инфицированных миколазмой клетках может быть сопряжено только с активацией NF-kB, вызванной контактом структурных компонентов миколазмы с рецептором TLR2, без вовлечения дополнительных механизмов.

Рисунок 15. Активация NF-kB ассоциирована с подавлением активности р53.

Голубые столбцы – клетки, обработанные R-Pam2, фиолетовые столбцы - контрольные клетки. Верхний график отражает активацию NF-kB (активность люциферазы), нижний график – р53 (активность b-галактозидазы). Для активации р53 к клеткам добавляли различные концентрации ДНК-повреждающего агента цисплатины (10-100 мкМ).

Сформулированный вывод, однако, может быть верен только для клеток, экспрессирующих функиональный TLR2. Полученные результаты не объясняют подавления активности р53 в клетках не экспрессирующих TLR2 и не отвечающих активацией NF-kB в ответ на микоплазменную инфекцию, таких как, например, HCT-116.

Работа выполнена совместно с к. б.н. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России].

Персистенция микоплазм в опухолях простаты

В ходе проведенных исследований нами было показано, что микоплазменная инфекция способствует трансформации клеток и увеличивает их выживаемость в стрессорных условиях. То есть, полученные результаты, вкупе с опубликованными данными, позволяют сделать заключение, что микоплазменная инфекция может выступать в качестве опухолепромотирующего агента. При этом, следует отметить, что все исследования подтверждающие это предположение, были проведены только в модельных экспериментах на животных и, на сегодняшний день, работы, которые бы доказывали ассоциацию микоплазменной инфекции с опухолевыми или предопухолевыми заболеваниями человека в научной литературе отсутствуют. В связи с чем, целью нашего следующего исследования было попытаться обнаружить подобную взаимосвязь.

Для определения ассоциации микоплазменной инфекции с раком простаты мы проскринировали методом ПЦР 250 образцов ткани простаты, полученных от 125 больных с подозрением на рак простаты (схема исследования см. На Рис 16А.). В ходе скрининга было проведено детектирование трех основных видов микоплазм, наиболее часто обнаруживаемых в урогенитальном тракте человека - M. hominis, M. genitalium и U. urealitycum. Параллельно, для всех 125 пациентов было проведено гистопатологическое исследование (ММА Сеченова, кафедра урологии), согласно которому был поставлен определенный диагноз: доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП); простатическая интраэпителиальная неоплазия низкой или высокой степени (ПИН); рак простаты.

Каждый ПЦР-анализ проводился с одновременной детекцией последовательности ДНК, специфичной для микоплазмы и последовательности специфичной для ДНК человека (внутренний контроль, подтверждающий качество выделения ДНК из ткани простаты). На рисунке В. представлены репрезентативные результаты детекции ДНК микоплазмы в ткани простаты методом ПЦР. Верхняя полоса в треке (755 п. о.) – продукт амплификации ДНК человека (ген бета-актина), нижняя полоса – специфический продукт (342 п. о.), амплифицированный с ДНК (16S РНК) M. hominis. Результат амплификации, визуализированный в гель-электрофорезе показывает, что образцы, нанесенные в 5,6,8 треки, положительны по ДНК M. hominis, тогда как образцы 3,4,7 – отрицательны.

Анализируя аналогичным образом оставшиеся образцы (250 шт.), мы обнаружили, что в биоптатах 27 из 125 пациентов (21.6%) с предположительным диагнозом рак простаты, хотя бы в одном из образцов (биоптаты из правой или левой доли простаты) содержалась ДНК тестируемых видов микоплазм. Частота обнаружения видов микоплазмы представлена на рисунке 16Б. Среди исследованных видов, наиболее часто детектируемой была M. hominis

Эта микоплазма была выявлена у 19 из 125 пациентов (15.2%), тогда как M. genitalium и U. urealitycum были детектированы только у 5.6% и 0.8% пациентов, соответственно. Параллельно мы показали, что образцы ткани простаты не были контаминированы данными видами микоплазмы, как компонентами ректальной микрофлоры. Ни один из трех видов микоплазм не был диагностирован в ректальных мазках.

Для подтверждения присутствия микоплазмы в ткани простаты независимым методом были произведены высевы образцов ткани простаты на селективные для M. hominis и U. urealyticum среды, обогащенные аргинином. Высевы на M. genitalium не производились в связи с трудностями ее культивирования. Было обнаружено, что при высеве, частота встречаемости U. urealitycum была схожей с частотой ее обнаружения при использовании ПЦР (0.8%). Однако, частота обнаружения of M. hominis при использовании метода высева (6.3 %) была снижена по сравнению с ПЦР (15.2%). Полученная разница может иметь несколько объяснений. Наиболее вероятным представляется то, что метод высева имеет более низкую чувствительность (вследствие того, что патогенные микроорганизмы с разной эффективностью способны приспосабливаться к условиям культивирования in vitro). Другим объяснением может являться то, что в некоторых случаях мы могли детектировать методом ПЦР ДНК погибших микоплазм. Несмотря на разницу в чувствительности двух используемых методов, полученные результаты подтверждают присутствие в образцах простаты жизнеспособной микоплазмы, то есть подтверждают наличие инфекционного процесса в простате.

На следующем этапе 125 пациентов были сгруппированы в соответствии с их диагнозом (гистопатологическая оценка): (1) доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП), (2) простатическая интраэпителиальная неоплазия низкой степени (ПИН НС), (3) простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени (ПИН ВС), (4) рак простаты. Результаты ПЦР анализа для M. hominis и M. genitalium были разделены в соответствии с диагнозами (см. Табл. 3). Данные для U. urealitycum не представлены, так как данная микоплазма обнаруживалась крайне редко.

А.

Рисунок 16. Детекция микоплазмы в ткани простаты методом ПЦР.

(А.) Схема проводимого исследования,

(Б.) Частота детекции трех видов микоплазм в биоптатах простаты

(В.) Детекция ДНК M. hominis в ткани простаты. ДНК, экстрагированная из биоптатов простаты была использована для детекции ДНК M. hominis (16S рРНК ген). Для внутреннего контроля была амплифицирована последовательность гена β-актина человека. 1 – отрицательный контроль реакции; 2 – отрицательный контроль чистоты экстракции ДНК; 3-7 – образцы ДНК, выделенной из биоптатов простаты пациентов с подозрением на рак простаты. 8 – положительный контроль (ДНК человека, смешанная с ДНК M. hominis); 9 –ДНК-маркер

Таблица 3. Распределение частоты встречаемости M.hominis и M.genitalium в зависимости от диагноза

Диагноз	Количество пациентов	M. hominis-положительные	M. genitalium-положительные	M.hominis- и M.genitalium-положительные
ДГП	30	2 (6,7%)	1(3,3%)	3(10%)
ПИН НС	14	1 (7,1%)	1 (7,1%)	2(14,3%)
ПИН ВС	23	3 (13%)	0(0%)	3(13%)
Рак простаты	58	13 (22,4)	5(8,6%)	18(31%)
Общее количество	152	19 (15,2%)	7(5,6%)	26(20,8%)

Для анализа полученных данных мы объединили в одну группу пациентов с доброкачественными изменениями простаты (ДГП и ПИН НС), в другую группу были включены пациенты с диагнозами ПИН ВС (состояние с высокой вероятностью переходящее в рак простаты) и раком простаты. Из 81 пациента с диагнозом ПИН ВС и рак простаты%) были позитивными по M. hominis or M. genitalium. Большинство из этих пациентов были инфицированы M. hominis (16 из 81). При этом в данной группе M. hominis была детектирована в 3-раза чаще (20%), чем в группе ДГП и ПИН НС (6.8%). Если проанализировать полученные данные по встречаемости ПИН ВС и рака простаты в M. hominis-позитивных и M. hominis-негативной группе, то ассоциация между микоплазменной инфекцией и раком простаты становится еще более очевидной. 84.2% M. hominis-позитивных пациентов имели диагноз ПИН ВС и рак простаты, тогда как M. hominis-негативные пациенты имели подобные диагнозы в 57.6% (p=0.033).

Таким образом, результаты проведенного ПЦР-скрининга образцов простатной ткани на предмет присутствия в ней ДНК микоплазм, показывают, что данная ткань бывает часто инфицирована M. hominis и эта инфекция преобладает у пациентов с диагнозом ПИН ВС и рак простаты по сравнению с пациентами, имеющими доброкачественные изменения в простате.

Для независимого подтверждения наличия у пациентов микоплазменной инфекции, дополнительно к детекции ДНК M.hominis методом ПЦР, мы определяли присутствие в сыворотке больных специфических по отношению к M. hominis IgG антител. Сыворотки были получены от 118 пациентов. Полученные сыворотки использовались для ИФА-анализа, предназначенного для детекции IgG антител, специфичных к рекомбинантному белку р120 M. hominis. Как видно из данных представленных на рисунке 38 35% и 44,8% ПИН ВС и раком простаты были позитивны по присутствию антител к M. hominis. При этом в группах с ДГП и ПИН НС было детектировано только 19% позитивных по антителам к микоплазме пациентов. Корреляция между частотой позитивных по ИФА пациентов в группе ПИН ВС/рак по сравнению с группой ДГП/ПИН НС была статистически достоверной (р=0.042).