Модуляция активности транскрипционных регуляторов p53 и NF-kB в условиях микоплазменной инфекции как фактор, способствующий трансформации эукариотических клеток и опухолевой прогрессии (стр. 1 )

На правах рукописи

Логунов

Денис Юрьевич

Модуляция активности транскрипционных регуляторов p53 и NF-kB в условиях микоплазменной инфекции как фактор, способствующий трансформации эукариотических клеток и опухолевой прогрессии

03.02.03 – «микробиология»

03.01.03 – «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика » Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России)

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор,

доктор биологических наук, профессор,

Ведущая организация: ФГБУ "ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России

Защита диссертации состоится « » 2011 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России ( )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Микоплазмы (класс Mollicutes) – мельчайшие патогенные бактерии, характерной особенностью которых является отсутствие клеточной стенки. Представители данного семейства являются причиной различных заболеваний респираторного и урогенитального тракта, а также острых и хронических заболеваний суставов у человека и животных [, , 1995]. Одной из особенностей микоплазм является их способность персистировать in vivo в течение длительного периода без каких-либо клинических проявлений. Такая способность микоплазм обусловлена рядом особенностей, которые позволяют им эффективно «ускользать» от иммунной системы хозяина. Для микоплазм свойственна молекулярная мимикрия и фенотипическая пластичность, которые приводят к тому, что микоплазмы не эффективно распознаются и элиминируются иммунной системой хозяина. Это позволяет микоплазмам сохраняться в организме хозяина в течение длительного времени, что часто может являться причиной хронических заболеваний [Barile M., 1993, Razin S.,1991,1998]. Другой характерной особенностью микоплазм является их способность к длительному персистированию in vitro - в культурах эукариотических клеток. Являясь облигатными мембранными паразитами, они сохраняются в клеточных культурах в течение десятков лет. Эта способность микоплазм создает уникальную модель для наблюдений и исследований взаимодействия прокариотических и эукариотических клеток.

В настоящее время, считается, что патогены, вызывающие хронические заболевания, ассоциированные с хроническим воспалением, являются одним из ключевых факторов, влияющих на опухолевую прогрессию [Coussens L., 2002, DeMarzo A., 2004, 2007, Gupta S., 2004, Karin M., 2006, Nelson W., 2003, Platz E., 2004, Sfanos K., 2008, Sutcliffe S., 2008, Wagenlehner F., 2007]. Примерами таких патогенов являются: вирус Эпштейна-Барр (назофарингеальная карцинома); вирусы гепатита B и C (гепатоцеллюлярная карцинома); папилломавирус человека (аногенитальные опухоли); паразит Clonorchis sinensis (холангиокарцинома) [Parkin D., 1993, Ames B., 1995, Karin M., 2006, Keam S., 2008, Mantovani F., 2001, Mager D., 2006], среди патогенов бактериальной природы - Helicobacter pylori (мукоза-ассоциированные опухоли и аденокарцинома желудка) [ Correa P., 2007, Ito M., 2009 , Malfertheiner P., 2005, Marshall B., 2005]. Еще целый ряд патогенов бактериальной природы в настоящее время подозреваются в качестве этиологических факторов различных опухолевых заболеваний: Salmonella typhi (опухоли желчного пузыря); Streptococcus bovis (опухоли кишечника); Bartonella sp. (гемангиомы) [Dehio C., 2005, Ellmerich S., 2000, Mager D., 2006, Tewari M., 2010].

Хроническая природа микоплазменной инфекции позволяет предположить, что она также может являться источником хронического воспалительного процесса и ассоциированных с ним проканцерогенных эффектов в условиях in vivo. Дополнительными аргументами в пользу этого предположения являются такие эффекты in vitro, сопровождающие хроническую микоплазменную инфекцию, как повышение генетической нестабильности в инфицированных культурах клеток [Allison A., 1966, Chernova O., 1996, Paton G., 1965], иммортализация и злокачественная трансформация клеток [Paton G., 1965, Cimolai N., 2001, Feng S. 1999 , Namiki K., 2009, Logunov D., 2008, Pehlivan M., 2005, Zhang B. 1996, Zhang C. 2004, 2006, 1975]. Также показано, что сами микоплазмы и их структурные компоненты способны блокировать апоптоз, повышать инвазивность клеток опухоли и стимулировать прогрессию опухолевого заболевания [ 1975, Ketcham С., 2005, Pehlivan М., 2005, Gerlic М., 2007, Gong М., 2008, Ushio S., 1995, 2008]. Последнее, по-видимому, связано с активацией основного провоспалительного и анти-апоптотического транскрипционного фактора NF-kB в результате взаимодействия структурных микоплазменных белков (липопептидов) с рецепторами врожденного иммунитета – TLR2/6.[ 2009]

На сегодняшний день, несмотря на значительный интерес со стороны ученых и наличие большого числа научных фактов, механизмы, характеризующие опухолестимулирующую и трансформирующую активность микоплазм остаются практически неизученными.

Известно, что одними из ключевыми клеточных факторов, активность которых изменяется более чем в 90% опухолевых клеток являются NF-kB и р53. При этом активность NF-kB в опухолях повышается, а функция р53 подавляется. NF-kB, контролирует экспрессию значительного числа генов, продукты которых важны для выживания опухолевых клеток и для опухолевой прогрессии. В списке таких генов цитокины (IL-1,6, TNFa и др.); хемокины (KC-1, MIP-2, Gro1); ростовые и ангиогенные факторы (GM-CSF, VEGF, IL-6); протеазы (ММР-9); анти-апоптотические факторы (Bcl-2, Bcl-XL, c-FLIP); проинфламаторные ферменты (COX-2, iNOS); гены, стимулирующие прогрессию клеточного цикла (циклин D1) [Karin М., 2006]. р53, наоборот, является главным опухолевым супрессором, основными функциями которого являются поддержка генетической стабильности и супрессия аберрантной активности онкогенов.

В нашей работе было проведено изучение влияния различных видов микоплазм на активность ключевых стресс-активируемых транскрипционных факторов р53 и NF-kB, а также оценен вклад подавления их активности в трансформирующую и опухолестимулирующую активность микоплазм.

Получение новых данных, связанных с изучением трансформирующей активности микоплазм, а также влияния ее компонентов на прогрессию опухолевого заболевания, имеет существенное значение для понимания механизма взаимодействия бактериальных патогенов с клетками хозяина, а также для выяснения роли хронических бактериальных инфекции в прогрессии опухолевых заболеваний. Поэтому изучение описанных свойств микоплазм в настоящее время представляет научный и практический интерес.

В целом исследование молекулярных механизмов взаимоотношения микоплазм с клетками хозяина даст возможность адекватно оценить значение микоплазм при многих патологических процессах.

Цель работы: Изучить влияние различных видов микоплазм на активность ключевых стресс-активируемых транскрипционных факторов р53 и NF-kB и оценить взаимосвязь модуляции активности этих факторов с трансформирующими и опухолестимулирующими свойствами микоплазм.

Задачи:

1. Отработать условия экспериментального заражения культур клеток различными видами микоплазм с последующей количественной оценкой микоплазм в инфицированных клетках.

2. Провести анализ способности микоплазм влиять на активность транскрипционного фактора р53 и р53-зависимые процессы – апоптоз и арест клеточного цикла.

3. Оценить влияние микоплазм на активность транскрипционного фактора NF-kB в результате взаимодействия с различными Толл-подобными рецепторами в экспериментах in vitro.

4. Провести анализ экспрессии Толл-подобных рецепторов, участвующих в распознавании липопептидов микоплазм, в различных линиях опухолевых клеток и отобрать клеточные культуры, экспрессирующие специфические по отношению к микоплазме Толл-подобные рецепторы.

5. Изучить влияние Толл-рецептор-зависимой активации NF-kB в условиях микоплазменной инфекции на выживаемость отобранных клеточных культур, в условиях генотоксического стресса.

6. Изучить влияние микоплазмы на пролиферацию и резистентность к химиотерапии опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы специфические к микоплазме, в экспериментах in vivo.

7. Провести анализ ассоциации микоплазменной инфекции с опухолевыми заболеваниями, основным этиологическим фактором которых считается хроническое воспаление.

Научная новизна

Впервые показана способность микоплазм ингибировать активность транскрипционного фактора р53. Установлено, что в результате ингибирования р53 в инфицированных клетках повышается устойчивость к апоптозу, а также ослабляется сенесенс-ассоциированный арест (арест, ассоциированный со старением) и арест, вызванный генотоксическими агентами. Проведено полногеномное исследование изменения экспрессии генов. Показано, что в клетках инфицированных микоплазмой снижена экспрессия таких известных р53-регулируемых генов как BTG-2, p21 Cip1, TP53I3, MDM2, ATF3, Fas.

Впервые идентифицированы сочетания Толл-подобных рецепторов, специфически распознающих M.arginini и ее структурные компоненты, при взаимодействии с которыми наблюдали активацию транскрипционного фактора NF-kB. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизма распознавания врожденной иммунной системой хозяина клеток M.arginini.

Впервые показана способность микоплазм и их липид-ассоциированных мембранных белков подавлять апоптоз в опухолевых клетках при действии химиотерапевтических препаратов в результате активации транскрипционного фактора NF-kB, опосредованной Толл-подобными рецепторами. Такая активация NF-kB в инфицированных микоплазмой клетках является одной из причин снижения транскрипционной активности белка р53.

На модели мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B в эксперименте in vivo впервые показана способность M.arginini и ее структурных компонентов (диациллипопептидов) повышать пролиферацию и устойчивость к действию химиотерапевтических препаратов опухолевых клеток, экспрессирующих Toлл-подобный рецептор 2.

Для изучения возможного механизма опухолестимулирующего действия микоплазменных липопептидов проведено полногеномное исследование изменения экспрессии генов. Показано, что введение синтетического диациллипопептида микоплазм вызывает индукцию более 3000 генов, среди которых обнаружены гены MCP-1, MCP-3, Gro1, RANTES, IL-1, IL-6, ФНОа, S100A9, SAA1, SAA3, продукты которых обладают опухолестимулирующей активностью.

Впервые изучено влияние микоплазменной инфекции на изменение метаболического профиля клетки-хозяина. Было показано, что наряду с известным по данным литературы, снижением содержания аргинина, в инфицированных микоплазмой клетках существенно понижается содержание пролина.

Практическая значимость

Результаты, полученные в данной работе, показывают, что сама микоплазма или ее антигены, которые, как известно, способны к длительной циркуляции в организме, могут негативно влиять на рост и устойчивость к химиотерапии опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6.