Микроэкологические нарушения у матери и ребенка: диагностика, прогностическое значение (стр. 3 )

·  отсутствие в анамнезе антибактериальной терапии и ОКИ за 2 месяца до проведения исследования.

После оформления согласия на медицинское вмешательство и в соответствии с критериями включения и исключения были сформированы профильные группы детей:

1 группа – здоровые дети раннего возраста (176 детей), которые по совокупности анамнестических и клинических данных на момент обследования не имели симптомов острых заболеваний и имели нормальный стул. Все дети до 6 месяцев получали грудное вскармливание. Проводилось бактериологическое исследование состава микрофлоры толстой кишки (ТК). У 79 детей исследование проведено в динамике дважды в разные возрастные периоды. У 20 детей грудного возраста дополнительно было проведено изучение видового состава, а также антибиотикорезистентности и антагонистической активности кишечных лактобактерий.

2 группа - 173 ребенка с клинически выраженными формами дисбактериоза кишечника (ДБК), в т. ч. 91 ребенок, рожденный естественным путем (ЕР) и 82 ребенка, рожденных путем кесарева сечения (КС). Группы были сопоставимы по частоте грудного вскармливания (ЕР – 74,7% и КС - 72%; р=0,7 критерий χ2). Проводились «когортные исследования» о влиянии способа родоразрешения на формирование кишечной микрофлоры и клинические проявления ДБК у детей. Бактериологические исследования фекалий и клиническое обследование проведены в возрасте 1-2 месяца, 6-12 месяцев, 1-2 года, 2-3 года.

3 группа – 72 ребенка с клинически выраженными формами ДБК, одновременно с ними обследовано 72 матери. Все дети получали грудное вскармливание. У детей проведено бактериологическое исследование фекалий, у матерей – бактериологическое исследование состава микрофлоры ТК, зева, носа, кожи грудной железы. У 46 матерей проведено исследование грудного молока на общее содержание SigA и антибактериальных и антиэндотоксиновых антител.

Отдельную группу, включенную в исследование, составили 743 матери, у которых было проведено исследование грудного молока на стерильность. В 408 случаях матери обследованы в стационарных условиях по поводу гнойно-воспалительных процессов, пневмонии, ОКИ у доношенных новорожденных и грудных детей. В 335 случаях матери обследованы в амбулаторных условиях, по поводу клинически выраженных случаев ДБК у детей грудного возраста.

Таблица 1

Возраст обследованных детей

Возраст при обследовании	1 группа (n=255)	2 группа (n=173)	3 группа (n=72)
КС (n=91)	НР (n=82)
1-6 месяцев	66	91	82	56
7-12 месяцев	51	87	60	16
1-2 года	78	69	50	-
2-3 года	60	31	33	-

Состояние здоровья пациентов оценивалось при помощи общеклинических методов исследования (клинический осмотр, общий анализ крови и мочи, копрограмма). При необходимости обследование дополнялось инструментальными методами обследования (УЗИ) и консультациями гастроэнтеролога, аллерголога и других специалистов.

Бактериологическое исследование фекалий и оценку количественного и качественного состава кишечной микрофлоры толстой кишки проводили в соответствие с Отраслевым Стандартом «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004–2003, Приказ Министерства здравоохранения РФ № 000 от 01.01.2001). Бактериологическое исследование мочи, а также отделяемого зева и носовой полости проводили в соответствие с Приказом № 000 Министерства здравоохранения СССР от 01.01.2001 г. Бактериологическое исследование грудного молока проводили в соответствии с методическими рекомендациями по бактериологическому контролю грудного молока МЗ СССР (1984). Степень обсеменения грудного молока различными микроорганизмами выражалась в КОЕ/мл. Определение видовой принадлежности лактобацилл проводили при помощи ПЦР с набором праймеров, приведенных в таблице 2, на базе лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. РАМН. В качестве контрольных использовали пробиотические штаммы L. acidophilus ВКМ В846, L. plantarum 8PA-3, L.fermentum 97, L. rhamnosus GG, L. delbrueckii 78 NCIB, L.casei 1-25 (, 2009.). Антагонистическую способность лактобацилл выявляли на специальной плотной питательной среде методом отсроченного антагонизма. В качестве контроля использовался производственный штамм бактериоцинпродуцирующий Lactobacillus plantarum 8RA-3 и штамм L. fermentum 97 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. РАМН г. Москва. В качестве индикаторных культур изучали штаммы S.aureus, E.coli Hly+, Klebsiella рnevmoniae, Klebsiella оxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, выделенные у детей с дисбактериозом кишечника. Антагонистическая активность лактобацилл оценивалась как высокая при ширине зоны задержки роста УПМ > 25 мм, умеренная – 13-25 мм и низкая – 0-12 мм (Hütt P. et al, 2006).

Чувствительность к антимикробным веществам лактобактерий определяли методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton с помощью стандартных дисков фирмы HiMedia (Индия) в соответствии с методиками, рекомендованными NCCLS (Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard – Seventh Edition. Document M2–A7, M100–S11, 2000-2001). Оценку антибиотикочувствительности и метициллинрезистентности штаммов S. aureus и S. epidermidis проводили дискодиффузионным методом в соответствии с методиками NCCLS (2000-2001). Определение общего содержания SIgA в грудном молоке проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Таблица 2

Праймеры, использованные в работе

ген мишень	олигонуклеатидные последовательности	GenBank/ EMBL	локализация на гене	размер ампликона (п. н.)	температура отжига (0С)
Lactobacillus. sp. (V2-V3 регион 16S rRNA)	LactoF 5/- TGGAAACAGRTGCTAATACCG -3/, R-G/A LactoR 5/- GYCCATTGTGGAAGATTCCC -3/, Y-T/C	M58802	172-192 384-403	232	58 (62)
L. acidophilus (V2-V3 регион 16S rRNA)	Aci 16SI 5/- AGCTGAACCAACAGATTCAC -3/ 16SII 5/- ACTACCAGGGTATCTAATCC -3/	M58802	70-89 809-829	759	55 (62)
L. plantarum (16S-23S область)	Lfpr 5/- GCCGCCTAAGGTGGGACAGAT -3/ Planll 5/- TTACCTAACGGTAAATGCGA -3/	AF080101	115-135 378-397	283	59 (55)
L. delbrueckii (V1-V2.2 регион 16S rRNA)	LdelbF 5/- GGRTGATTTGTTGGACGCTAG -3/, R-G/A LdelbR 5/- GCCGCCTTTCAAACTTGAATC -3/	AY050171	80-100 197-217	138	54 (60)
L. fermentum (V1-V3 регион 16S rRNA)	LfermF 5/- GCACCTGATTGATTTTGGTCG -3/ LactoR 5/- GYCCATTGTGGAAGATTCCC -3/, Y-T/C	M58819	98-118 395-414	317	59 (60)
L. fermentum (16S-23S область)	Lfpr 5/- GCCGCCTAAGGTGGGACAGAT -3/ Fermll 5/- - CTGATCGTAGATCAGTCAAG -3/	AF080099	119-139 375-394	276	59 (55)
L. rhamnosus (V1-V2.2 регион 16S rRNA)	LrhamF 5/- TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG -3/ LcaseR 5/- GGTTCTTGGATYTATGCGGTATTAG -3/, Y-T/C	D16552	61-84 158-182	122	62 (62)
L. rhamnosus (16S-23S область)	PrI 5/- CAGACTGAAAGTCTGACGG -3/ Rhall 5/- GCGATGCGAATTTCTATTATT -3/	AF121201	8-26 173-193	186	54 (58)
L. casei/ L. paracasei (V1-V2.2 регион 16S rRNA)	LcaseF 5/- GCACCGAGATTCAACATGG -3/ LcaseR 5/- GGTTCTTGGATYTATGCGGTATTAG -3/, Y-T/C	D86517/ D79212	66-84 158-182	117	62 (60)
L. casei (16S-23S область)	PrI 5/- CAGACTGAAAGTCTGACGG -3/ CasII 5/- GCGATGCGAATTTCTTTTTC -3/	AF121200	8-26 173-192	185	54 (55)
L. zeae (16S-23S область)	Zeal 5/- TGTTTAGTTTTGAGGGGACG -3/ Zeall 5/- ATGCGATGCGAATTTCTAAATT -3/	AF074862	48-67 173-194	147	55 (58)

Количественные результаты выражали в мг/мл. Определение антибактериальных и антиэндотоксиновых SIgA в грудном молоке проводили методом ИФА. В качестве антигенов эндотоксинов использовали гликолипид Salmonella minnesota RE 595 (Sigma, USA), липополисахарид E.coli (Sigma, USA). В качестве антигенов Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staph. aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans использовали ультразвуковые дезинтеграты этих бактерий, подвергнутые ультрацентрифугированию, гельфильтрации и очистке от нуклеиновых кислот цетавлоном ( и др. 1999). Результаты ИФА выражали в мг/мл и мкг/мл. Определение концентрации эндотоксина в моче проводили при помощи модифицированного ЛАЛ-теста ( и соавт., 2001 г.). Метод основан на визуализации под микроскопом свертывания ЛАЛ-реагента под действием эндотоксина (ЭТ). В присутствии эндотоксина (положительный результат, рис. 1), в высохшей капле от центра к периферии формируются фракталы, величина которых зависит от концентрации эндотоксина. При снижении количества вносимого ЭТ меняется геометрия фракталов, они большей частью формируются по периферии, а центр заполняется неорганизованными кристаллами (отрицательный результат, рис. 2).