Микробиология (стр. 12 )

Кипятильник Коха представляет собой металлический цилиндр, обычно накрытый теплоизолирующим слоем, чаще всего - асбестом. Внутри цилиндра находится сетчатое ведро или подставка на ножках, куда помещают стерилизуемый материал, прикрыв его клеёнкой для защиты от конденсационной воды. На дно цилиндра наливают воду так, чтобы уровень ее не доходил до дна подставки. Кипятильник за­крывают крышкой, в которой имеется отверстие для выхода пара, и нагревают с помощью газовой горелки или электричества. В современных аппаратах Коха имеются терморегуляторы.

В промежутки между прогреваниями среды помещают на сутки в термостат, отрегулированный на 30°С, для проращивания спор. Субст­раты, не выдерживающие нагревания при 100°С, прогревают более осто­рожно: при 70-80°С по 1 ч ежедневно в течение 3 дней или при 60-65°С в течение 5 дней. Между нагреваниями их выдерживают при темпера­туре от 25 до 37°С.

Тиндализация обеспечивает стерильность лишь в том случае, если среда, в которой находятся споры и поддерживаемая между прогрева­ниями температура обеспечивает их прорастание, и с другой стороны, если появившиеся вегетативные клетки вновь не образуют термостой­кие споры. Существенным недостатком дробной стерилизации является и то, что она требует большой затраты времени. Вот почему практиче­ское значение тиндализации в настоящее время весьма ограничено. Этим способом пользуются преимущественно для стерилизации некото­рых термолабильных лекарственных веществ и иногда - желатины.

·  Стерилизация фильтрованием

Стерилизация фильтрованием широко используется в микробиологической практике. Она применяется для субстратов, не выдерживающих нагревания, например, для жидких сред и растворов, содержа­щих термолабильные белки, витамины, сахара, некоторые антибиоти­ки, а также для сывороток, летучих веществ, например некоторых уг­леводородов и других. Этим способом освобождают культуральную жидкость от клеток микроорганизмов, когда необходимо сохранить содержащиеся в ней продукты обмена в неизменном виде.

Способ заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры, называемые бактериальными. Микробные клетки задерживаются фильтрами главным образом механически, поскольку они крупнее диаметра пор фильтра, а также потому, что поры идут через фильтр чрезвычайно извилисто и на всём протяжении имеют разную форму и неодинаковый размер. Если же фильтр изготовлен из положительно заряженного материала, то имеет место и притягивание бактерий к стенкам пор, поскольку большинство микроорганизмов в водной суспензии имеет на своей поверхности отрицательный заряд. Такой фильтр может эффективно задерживать даже те микроорганизмы, средние размеры которых несколько меньше среднего диаметра пор. Тем не менее поры фильтров должны быть достаточно мелкими не только затем, чтобы обеспечить механическую задержку клеток, но и для того, чтобы микроорганизмы оказались в сфере действия элект­рического заряда стенок.

Диаметр пор определяет область применения фильтров. Стерили­зующими бактериальными фильтрами теоретически можно считать та­кие, размер пор которых не превышает 0,75 мкм. В практике пригод­ность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной филь­трации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например Pseudomonas aeruginosa. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высеивают на питательную среду. Если в течение 5 дней тест – организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Как правило, бактериальные фильтры пропускают L – формы бактерий, вирусы и бактериофаги.

Типы бактериальныx фильтров. Бактериальные фильтры изготавливаются из разных материалов. Они различаются по форме и диаметру пор, обычно указанному на упаковке фильтра или в прилагаемом паспорте. Нередко фильтры выпускаются под определёнными номерами и марками.

Мембранные (коллоидные) фильтры готовят на основе нитроцеллюлозы. Отечественная промышленность выпускает мембранные фильтры диаметром 35 мм. Они представляют собой диски – разного диаметра толщиной 0,1-0,5 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются номерами от 1 до 5.

Во Франции и США фирма «Миллипор» выпускает фильтры с раз­мером пор от 0,01 до 14 мкм.

В последнее время получили распространение мембранные фильтры фабрики «Синпор» ЧССР.

Мембранные фильтры задерживают микроорганизмы почти исключительно благодаря малым размерам своих пор. Адсорбция здесь иг­рает незначительную роль. Через эти фильтры пропускают небольшие объемы жидкости, так как при фильтровании больших объемов проис­ходит закупорка пор и оно затрудняется. Кроме того, при длительном фильтровании возможно прорастание микроорганизмов внутри пор и попадание их в фильтрат. Мембранные фильтры, имеющие диаметр пор 0,1 мм или меньше, называют ультрафильтратами. Их используют для фильтрации вирусов и высокомолекулярных белков.

Асбестовые фильтры известны под названием фильтров Зейтца. Их изготавливают из смеси асбеста с целлюлозой в виде боль­ших плотных (4-6 мм толщиной) листов, которые затем разрезают на диски или квадраты разной величины. Верхняя поверхность пластин флокулирована. Плотность фильтров тем выше (т. е. меньше пористость), чем больше в них асбеста. На пористость фильтров указывают обозначения, имеющиеся на пластинах: индекс ЕК соответствует диаметру пор 1,5-1,8 мкм; EKS - 1,2-1,5; EKS-l - 1-1,2; ЕКП 0,8-1 мкм. Кроме того, в СССР выпускаются асбестовые фильтры, обозначаемые марками Ф2 и СФ. Стерилизующими являются пластины СФ-3 и СФ-4.

Асбестовые фильтры имеют ряд недостатков. Один из основных связан с их химическим составом: при фильтровании из них могут вы­мываться щелочи, соли щелочных металлов, а иногда и соли железа.

Фильтрат загрязняется нежелательными примесями и приобретает ще­лочную реакцию. Это затруднение можно преодолеть путем предварительного промывания фильтра последовательно разведенной кислотой

и дистиллированной водой или удалением первых порций фильтрата.

Другой существенный недостаток фильтров Зейтца состоит в том, что

асбест, будучи отрицательно заряженным, может адсорбировать значителъные количества различных веществ из фильтруемой жидкости.

И, наконец, асбестовые фильтры нередко загрязняют фильтрат волок­нами. Асбестовые пластины относительно, мягкие, они легко искривля­ются и разрываются. Помятые фильтры, а также пластики с надло­мами и трещинами для работы непригодны.

Фарфоровые фильтры были впервые предложены Пастером и Шамберланом в 1884 году. Впоследствии они получили название «свечи

Шамберлана». Их изготавливают из смеси кварцевого песка и каоли­на, прокалённых на огне. Они имеют форму полого цилиндра, закры­того на одном конце. Верхняя часть цилиндра глазурованна. Особенно часто применяются свечи трех размеров: 10 Х 55, 15 Х 105 и 25 Х 205 мм. Пористость их обозначается буквой L с цифрами от 1 до 13, соответственно увеличению плотности фильтра, т. е. уменьшению диа­метра его пор - от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые свечи обозначаются также маркой «В», крупнопористые - маркой «F». Последние исполь­зуются только для фильтрации воды и отделения мелких микроорга­низмов от крупных. Свечи Шамберлана имеют положительный заряд.

Фильтры из инфузорной земли готовят из диатомита или кизельгура, нередко с добавлением асбеста или других материалов. В России выпускается несколько типов таких фильтров под различны­ми названиями. Чаще всего их называют «свечи Беркефельда». Это замкнутые с одного конца цилиндры 5-26 Х 1,5-5 мм, имеющие в верхней части фарфоровую или металлическую головку «Свечи Беркефельда» имеют обозначения W, N, и V, что соответствует диаметрам пор 3 – 4, 5 – 7, 8 – 12 мкм.

Фильтры из стекла. Стерилизующие стеклянные фильтры представляют собой двуслойные диски, изготавливаемые из фрагмен­тов стекла «Пирекс» путем их сплавления. Нижний слой, имеющий по­ристость в пределах 15-40 мкм, служит подставкой. На ней лежит бактерионепроницаемый верхний слой. Это тонкая мелкопористая пластинка. По пористости такие пластинки разделяются на три типа: P - диаметр пор меньше 1 мкм, М - от 1 до 1,7 мкм, С - больше 1,7 МКМ. Но, по­скольку стеклянные фильт­ры отличаются нестандарт­ностью пор, в паспорте, прилагаемом к каждому фильтру, обычно указывается средний диаметр пор данного фильтра. Диски впаяны в стеклянные воронки-держатели. Форма их может быть разной. Осо­бенно широкое распростра­нение получили фильтры Нутча и воронки Бюхнера ( рис. 35) с диаметром пла­стин от 30 до 120 мм.

Стеклянные фильтры имеют отрицательный за­ряд. Но они не столь ак­тивно адсорбируют вещества при фильтровании, как асбестовые, и не загрязняют фильтрат, поскольку материал фильтра из них не вымывается. Из-за нестандартности пор фильтры из стекла перед употреблением обязательно должны быть проверены на стерилизующий эффект.

В настоящее время из всех типов бактериальных фильтров для стерилизации наиболее широко применяются мембранные и асбесто­вые фильтры.

Рисунок 35. Свеча Беркефельда

Рисунок 36. Стеклянный фильтр (воронка Бюхнера), вмонтированная в колбу Бунзена

Работа с бактериальными фильтрами включает ряд этапов:

1.Подготовка фильтров. Фильтр должен быть закреплен в держателе, который вставляется в приемник фильтрата. Обычно при­емником является колба Бунзена.

Для мембранных фильтров имеются многочисленные держатели. Есть, например, прибор, изготовленный целиком из стекла, в котором в качестве опоры фильтра используется крупнопористый стеклянный диск (рис. 37, А). Чаще применяются металлические и пластмассовые держатели. Все они приспособлены для дисков различного диаметра и рассчитаны на фильтрование разных объемов жидкостей.

Асбестовые фильтры монтируют в металлические основы, которые известны под названием «приборы Зейтца» (рис. 37, Б). Асбестовая пластина крепко зажимается винтами между верхней (цилиндр без дна) и нижней (воронкообразный тубус) частями держателя. Опорой для асбестового диска служит сетка или пористая пластинка из не­ржавеющей стали. Трубка держателя, по которой стекает фильтрат, че­рез резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца.