Микробиология (стр. 14 )

Бактериальные фильтры нельзя мыть смесью двухромовокислого калия с серной кислотой, так как хромат адсорбируется на фильтре, что может повредить фильтр и испортить фильтрат. Свечи не следует также обрабатывать, концентрированными растворами щелочей, поскольку это моет увеличить размеры их пор.

ГЛАВА 4

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в ла­бораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изуче­ния и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для их жизнедеятельности.

ПРИНЦИПЫ СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД

ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на пита­тельных средах, поэтому питательная среда должна содержать все ве­щества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для био­синтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процес­сы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разно­образны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культиви­рования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы.

Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту - соединение, содержа­щее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекисло­той, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступления в среду за счет диффузии недостаточно для интен­сивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NаНС) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (СаС). В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный 1-5% углекислоты.

Потребности гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удов­летворены только углекислотой. Для их развития среда должна содер­жать органические соединения. В зависимости от индивидуальных осо­бенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различ­ные соединения yглepoдa - кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. При этом потребности некоторых микроор­ганизмов, например ряда бактерий из семейства Pseudoтonadaceae, могут быть удовлетворены широким набором различных органических веществ, тогда как другие микроорганизмы характеризуются высокой специализацией и способностью использовать лишь немногие соедине­ния углерода, Так, некоторые метанокисляющие бактерии используют только метан и метанол. ­

Вторым основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме - в виде амино(-N) или имино(-NН)-групп. Тем не менее потребности микроорганизмов в источни­ке азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими сое­динениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят NCl или (N)S. Следует, однако, помнить, что аммонийные соли – физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион со­ответствующей кислоты. Что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроор­ганизмов. Гидроксид аммония (NНОH) в качестве источника азота используют редко, пocкoльку он вызывает сильное подщелачивание питательных сред. ­

Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирова­ния таких микроорганизмов содержат КNО или NaNО. В отличие от солей аммония нитраты - физиологически щелочные соли, так как при использовании аниона NО- в среде накапливаются катионы К+ или Na+. Нитриты в кислых условиях для многих микроорганизмов токсич­ны, поэтому в качестве источника азота почти не используются.

Питательные среды для культивирования микроорганизмов, более требовательных к азоту и соответственно обладающих меньшими био­синтетическими способностями, должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- или DL - ­форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллирован­ной воде, фенилаланин и триптофан - в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты - в дистиллированной воде, подкисленной HCl. Аминокислоты - цистин и цистеин, а также амиды - глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно сте­рилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин.

Потребности микроорганизмов в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, ка­зеин) или растительного (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с терпкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других используют гидролизат казеина, который готовят в лабаратории, как правило, кислотным гидролизом. Для этого 20 г казеина заливают 200 мл воды, добавляют 10 мл концентри­рованной HSO и выдерживают в автоклаве 4 ч при 1,5 атм. Однако при этом подвергается коррозии оборудование автоклава, поэтому чаще гидролизат казеина получают иначе. К 200 г казеина добавляют 280 мл 6н раствора НСl, и смесь кипятят с обратным холодильником 18 ч. Полученный гидролизат нейтрализуют 50%-ным раствором NaOH до рН 7, фильтруют; через бумажный фильтр и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Содержание аминного азота в гидролизате, полученном таким спосо­бом, составляет 700 – 1000 мг на 100 мл. Его добавляют к средам в та­ком количестве, чтобы концентрация по аминному азоту составляла 10-30 мг на 100 мл. Следует иметь в виду, что при кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, в достаточно большой степени цистеин и незначительно серин и треонин. Имеется готовый препарат гидролизата казеина. Его вносят в среды от 0,1 до 1,0 г на 100 мл в зависимости от потребностей микроорганизмов.

Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного рас­щепления - пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли - и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и ми­кроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитиче­ских ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (соевая мука) происхождения. В отечественных лабора­ториях чаще всего используют ферментативный пептон, выпускаемый Семипалатинским заводом. Это гигроскопический порошок светло-жел­того цвета, полностью растворимый в воде; 1 %-ный раствор пептона имеет нейтральную или слабокислую реакцию. В питательные среды пептон добавляют от 1-2 до 20 г на 1 л.

Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорга­низмы могут использовать не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии.

Некоторые бактерии способны использовать в качестве единствен­ного источника азота молекулярный азот - N. Это азотфиксаторы. В среды для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотфиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.

Помимо источников углерода и азота многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокнслоты. Для того чтобы подчеркнуть потребность, микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Этими терминами особенно широко пользуются в литературе по гене­тике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин В), пантотенат Са, рибофлавин (витамин B), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин B) - по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобен­зойная кислота - по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин - 0,005 мкг на 1 мл среды.