Микробиология (стр. 18 )

УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для жизнедеятельности микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

Активная кислотность среды

Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0, напротив, микроскопические грибы пред­почитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Измеряют рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораторной практике удобно использо­вать различные жидкие или бумажные индикаторы. Широко применяется, например, жидкий двухцветный индикатор, бром­тимоловый синий (бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге рН от 6,0 до 7,6. При рН 7,3 индикатор имеет си­не-зеленую oкраску. Используют также универсальный индикатор, ко­торый изменяет окраску в интервале рН от 2 до 10.

В случае необходимости рН сред доводят до нужного значения растворами кислот (HCl, HSO.), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (NаСО, NаНСО). Для корректировки рН целесообразно иметь растворы разной концентрации. рН сред мо­жет измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного значения, если это тре­буется, стерильными растворами кислоты или щелочи.

Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начального роста, достаточно часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Например, при сбраживании углеводов в среде на­капливаются органические кислоты, снижающие рН среды. В средах с КNО рН возрастает, как уже отмечалось, благодаря более интенсив­ному потреблению нитрат-иона и накоплению ионов калия.

Чтобы не допустить чрезмерного изменения рН в культурах микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы (см.

Приложение). В микробиологической практике чаще других применяют фофатные буферы. Однако если рост микроорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к средам ( не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению рН не беспредельно. Поэтому для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение буферов неэффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Можно нейтрализовать образующиеся кислоты по ходу развития культуры 10%-ным стерильным раствором NаНСО.

Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в процессе жизне­деятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их чис­лу относятся молочнокислые бактерии, а также многие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нужно поддерживать рН в слабощелочных средах, так как для диапазона рН от 7,2 до 8,5 подхо­дящих буферов не существует. Поэтому иногда приходится периодиче­ски или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контро­ле значения рН. В современных ферментерах это достигается с помощью специальных автоматических устройств.

Аэрация

Кислород входит в состав воды и органических соединений, поэто­му поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако многие микроорганизмы нуждаются в постоянном притоке молекулярного кис­лорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыха­ние, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя. Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофильных мик­роорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут при парциальном давлении меньшем, чем в воздухе. Развитие других мик­роорганизмов, напротив, возможно только, в отсутствие кислорода. По­лучение энергии у этих микроорганизмов не связано с использованием молекулярного кислорода. Для многих из них кислород токсичен – он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы на­зывают облигатными анаэробами. Среди микроорганизмов выделяют также группу факультативных анаэробов, представители которой спо­собны расти как в присутствии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. Например, некоторые дрожжи или энтеробактерии в зависи­мости от наличия кислорода осуществляют аэробное дыхание или брожение.

Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде определяют различия и в способах их культивирования.

Способы культивирования аэробных микроорганизмов

Культивирование на поверхности плотных и жидких сред. В этом

случае микроорганизмы выращиваются на поверхности плотной среды

или в тонком слое жидкой среды и получают кислород непосредствен­но из воздуха. При поверхностном культивировании важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды нали­вают тонким слоем в посуду с широким дном - чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы. В жидких средах аэробные ми­кроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факуль­тативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

Глубинное культивирование в жидких средах. Все способы глубин­ного культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличе­нию поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют pacтворённый кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика. Поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, её необходимо постоянно аэрировать.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок со скоростью 100-200 и более оборотов в минуту. Чем больше скорость вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно уменьшением объема среды или применением колб с отбойниками – вдавлениями внутрь в виде 4-8 отростков 2-3 см длиной. При вращении колб с отбой­никами поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости, тем выше аэрация.

Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов на качалках характеризуют, как правило, скоростью поглощения кислорода водным раствором сульфита. Раствор сульфита наливают в сосуды для культивирования вместо питательной среды и через определенные про­межутки времени измеряют количество окисленного сульфита в тех же условиях аэрации, при которых выращиваются исследуемые микроор­ганизмы. Метод подробно описан в «Практикуме по микробиологии» (1976). Сульфитный метод не дает возможности определить концентра­цию кислорода в культуре. Концентрацию кислорода, растворенного в культуральной жидкости, определяют полярографически.

Помимо перемешивания, аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием через толщу среды стерильного воздуха. Этот спо­соб часто используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы и различных продуктов жизнедеятельности мик­роорганизмов - антибиотиков, ферментов, кислот. Скорость протека­ния воздуха через среду необходимо контролировать. Для этого ис­пользуют различные приборы: газовые часы, реометры и другие. В фермен­терах количество пропускаемого воздуха поддерживается на заданном уровне автоматически. Воздух стерилизуется путем прохождения через активированный древесный уголь, стеклянную вату, пропитанную анти­септиком, или специальные ткани из полимеров. В лабораторных опы­тах, когда объем и скорость поступления воздуха невелики, используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для возможно более сильного распыления воздух пропускают через мел­копористые пластинки - барбатеры; в лабораторных опытах с этой целью при­меняют стеклянные фильтры.

Рисунок 42. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов: 1 – вход для воздуха, 2 – выход воздуха, 3 – барбатер, 4 –отбойники, 5 - мешалка

Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, используют обычный воздух. Продувание сред Кислородом не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до 40 мг/л) может привести к угнетению роста микроорганизмов. В ферментерах принудительную аэрацию обычно совмещают с меха­ническим перемешиванием среды мешал­ками, скорость вращения которых может достигать сотен и даже тысяч оборотов в минуту. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов приведена на рис. 42.

Необходимо помнить, что потребности в свободном кислороде у различных аэробных микроорганизмов неодинаковы, поэтому степень аэрации следует подбирать экспериментально для каждой культуры.