Микробиология (стр. 17 )

Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологиче­ски активных соединений, а также в коллекциях для сохранения куль­тур микроорганизмов. К таким средам относятся, например, разварен­ное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диаг­ностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. С целью уплотнения сред применяют агар или жeлатин. Плотной основой могут служить пластинки силиката, которые пропитывают питательной средой.

Рисунок 41. Приготовление скошенной агаризованной среды в пробирках

Агар используют для уплотнения сред особенно часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входит сахароза и агаропектин. Кроме того. Агар включает небольшое количество легко ассимилируемых ве­ществ и различные соли. Агар по­лучают из некоторых морских во­дорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100 ° C и затвердевает при температуре 40°C.

Поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных в настоящее время микроорганизмов.

Чаще всего агар добавляют к средам в количестве 1,5%. Если не­обходимо получить более влажную среду, вносят 1,0%, а более плот­ную и сухую -2-3% агара. Среду с агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если предполагают выра­щивать микроорганизмы на скошенной агаризованной среде в пробир­ках, то каждую пробирку заполняют средой не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают после стерилизации, перед посе­вом. Для этого пробирки с расплавленной на кипящей водяной бане средой устанавливают в наклонном положении (рис. 41) и дают среде застыть. Скошенная агаризованная среда не должна доходить до ват­ной пробки на 4-6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий в чашках Петри, разливают по 20-25 мл в пробирки боль­шего объема, чем для скошенной агаризованной среды, или стерилизу­ют в колбах. В последнем случае до стерилизации агар не расплавляют.

При остывании агаризованных сред образуется конденсационная вода. Чем меньше концентрация агара, тем больше выделяется воды. Поэтому при выращивании микроорганизмов на поверхности агаризованных сред в чашках Петри с целью получения изолированных коло­ний чашки помещают в термостат крышками вниз. В противном случае на внутренней стороне крышки скапливается конденсат, который, стекая на поверхность среды, мешает получению изолированных колоний.

Агар имеет слабощелочную реакцию, поэтому его добавление мо­жет привести к незначительному повышению рН среды. В слабокис­лых, нейтральных или слабощелочных средах агар сохраняет способ­ность образовывать гель после нескольких циклов плавления и затвердевания и даже после повторной стерилизации. Однако необходимо помнить, что при рН среды ниже 5,5 агар при стерилизации частично гидролизуется и поэтому теряет способность образовывать гель, т. е. не застывает. В этом случае его стерилизуют отдельно от среды в оп­ределенном объеме воды, расплавляют на водяной бане и приливают при постоянном перемешивании к стерильной, предварительно подогре­той среде.

Агар, как указывалось выше, содержит примеси органических и минеральных веществ, которые иногда нежелательны. Чтобы избавить­ся от большинства из них, поступают следующим образом. Агар зали­вают водопроводной водой и ставят в термостат на 30-37. Примеси вымываются в воду и разлагаются под действием развивающихся в ней микроорганизмов. Через день-два жидкость сливают, агар промывают несколько раз свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят в термостат. Когда и эта вода помутнеет, то ее опять заменяют новой, и так делают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Обычно через 2-3 недели получают агар, почти лишенный растворимых органических и минеральных веществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый мешок и 2-3 суток промывают проточной водопроводной водой, затем раскладывают его тонким сло­ем и просушивают на воздухе или в сушильном шкафу при 40-50.

Желатин - это экстракт, получаемый' из субстратов, богатых коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатином гель плавится при температуре 25°С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30 - 37°С). Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатина ог­раничивают его применение в качестве уплотняющего средства. Жела­тин используют главным образом в диагностических целях – для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей. В первом случае употребляют мясо – пептонный, во втором - сусловый желатин.

К жидким средам добавляют 10 – 20% желатин, оставляют набу­хать 5-10 мин и нагревают на водяной бане до растворения. Доводят рН среды до 6,8-7,0.Желатин имеет кислую реакцию и обладает большой буферностью, поэтому на нейтрализацию идет больше щелочи, чем, например, на нейтрализацию МПА. Желатиновые среды стерили­зуют при 0,5 атм 15 мин или дробно - 3 раза по 20 мин в кипятильни­ке Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред, особенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, поскольку желатин ча­стично гидролизуется и теряет гелеобразующие свойства.

Кремнекислый гель (силикагель) используют как твердую основу для синтетических сред строго определенного состава.

Гель готовят следующим образом. К соляной кислоте плотностью

1,1 добавляют при перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (NаSiO или КSiO) той же плотности., Смесь разливают в чашки Петри по 20-30 мл в каждую и оставляют чашки на горизон­тальной поверхности на несколько часов до образования кремнекислого геля. Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стек­лянный или эмалированный сосуд, промывают 2-3 суток проточной водой для удаления хлоридов, а затем несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе промывных вод с 1 – 5%-ным раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок. Отмытые от хлора пластинки пропитывают 2-3 мл концентрированной среды, содержание компонентов в которой в 5-10 раз выше, чем в соответствующей жидкой среде. Затем чашки с гелевыми пластинками помешают открыты­ми в сушильный шкаф и подсушивают при 50-60, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его поверхность осталась влажной. Если необходимо, чашки завертывают в бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать. Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Чашки с силикагелевыми пластинками сохраняют до употребления под водой.

Некоторые специфические особенности агара, желатин и кремнекислого геля суммированы в таблице 3.

Таблица 3.-Основные особенности веществ, употребляемых для уплотнения питательных сред

Следует помнить, что все среды с агаром или желатином следует относить к натуральным средам неопределенного состава.

Осветление сред. Осветленные агаризованные или желатиновые среды необходимы для некоторых специальных исследований, напри­мер для получения хорошо видимых изолированных колоний анаэробных микроорганизмов.

В ряде случаев прозрачную среду можно получить, отфильтровав ее от осадка через гигроскопическую вату. Когда этого бывает недоста­точно, среды осветляют с помощью белков куриного яйца. Для освет­ления 500 мл среды достаточно белка одного яйца. Бeлок отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования сплош­ной пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и остуженную до 45-50 среду. Перед внесением белка проверяют рН и, если необходимо, подщелачивают среду до рН 7,0-7,3. Среду с бел­ком тщательно перемешивают и прогревают при 100 в автоклаве или в кипятильнике Коха в течение часа. Белок свертывается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Когда свернувшийся белок под­нимется на поверхность или опустится вниз, среду быстро отфильтро­вывают в горячем виде через вату. При этом удобно пользоваться спе­циально подогреваемыми подставками для воронок, благодаря кото­рым предотвращается застывание среды во время фильтрования.

Синтетические агаризованные среды, в которые вносить белок не­желательно, осветляют следующим образом. Среду наливают в хими­ческий стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10-12 ч, обычно на ночь. При таком медленном остывании все взвешенные частицы оседают на дно. Застывшую агари­зованную среду извлекают из стакана, верхнюю, прозрачную часть срезают, помещают в колбу и вновь стерилизуют.

* * *

Посуда, предназначенная для приготовления сред и культивирова­ния микроорганизмов, не должна содержать посторонних веществ. Лучше всего пользоваться стеклянной посудой. Новую стеклянную посуду моют и погружают на ночь в 1-2%-ный раствор соляной или серной кислот, затем многократно промывают водой и высушивают. Иногда для работы с микроэлементами, витаминами, синтетическими и другими средами требуется особо тщательная очистка посуды. Натуральные среды неопределённого состава можно готовить в эмалированной посуде.

Не следует готовить впрок больших запасов сред, так как они вы­сыхают, концентрируются и становятся непригодными. Сохраняют сре­ды в прохладном, защищенном от света и не слишком влажном поме­щении. В сырости ватные пробки пропитываются влагой и через них может прорасти мицелий микроскопических грибов. Каждый сосуд со средой должен иметь этикетку с обозначением состава (названия) среды и времени ее приготовления.