Микробиология (стр. 20 )

- среды перед употреблением кипятят для освобождения от растворенного кислорода;

- к средам обязательно добавляют восстановители - цистеин,

сульфид Na, тиогликолат Na;

- пересевы, посевы, разлив сред в сосуды для культивирования

осуществляют в токе углекислоты или водородуглекислотной

смеси;

- культуры выращивают в герметически закрытых сосудах в ат­мосфере газовой смеси, часто с избыточным давлением;

- газы Н, СО или их смеси используют только после очистки от следов кислорода.

В последнее время для культивирования экстремальных анаэробов предложены специальные камеры, которые содержат внутри все необ­ходимое для выполнения бактериологических работ, включая термостат. Камера заполняется газовой смесью, состоящей из 10% Н, 10% СО и 80% N, освобожденной от примеси кислорода. Работу в камере исследователь проводит, надевая перчатки, вмонтированные в камеру. Это оборудование достаточно сложно и дорого, но оно имеет одно неоспоримое преимущество - контакт клеток микроорганизмов с воздухом исключается на всех этапах работы.

Температура

Интервалы температур, в которых возможен рост различных мик­роорганизмов, заметно варьируют. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37°С. У термофилов он значительно выше - от 45 до 60-70°С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5-10°С. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влия­ют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращиваются в термостатах (рис. 49) или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегу­ляторов поддерживается соответству­ющая оптимальная температура. Ме­зофильные бактерии, естественным местом обитания которых является вода и почва, выращивают в интер­вале от 20 до 30°С, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или ки­шечника человека и животных куль­тивируют при более высокой темпе­ратуре – 35 – 37°С.

Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Свет

Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые сол­нечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Поэтому такие микро­организмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естест­венное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фототрофы выращивают в люминостатах, то есть в камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необхо­димая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству.

Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и длинами волн, при которых осуществляют фотосинтез культивируемыe микроорганизмы. Для выращивания пурпурных и зелёных бакте­рий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования микроводорослей и цианобактерий можно

Рисунок 49. Термостат для культивирования микроорганизмов

применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спектрального состава света обращают внимание на интенсивность освещения, которую измеряют с помощью люксметра Ю-16.

Вода

Рост и размножение микроорганизмов невозможны без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в до­ступной для клетки форме, т. е. в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворенных веществ и не может быть использована микроор­ганизмами. Доступность воды в субстрате для развития микроорганизмов выражают величиной активности воды (а). а= Р/Р, где Р – давление пара раствора (мм рт. ст.), Р - давление пара чистой воды (мм рт. ст.) при данной температуре. Значение а для дистиллирован­ной воды равно 1,00. При растворении различных веществ в воде эта величина уменьшается и соответственно падает доступность для клетки воды.

Микроорганизмы могут расти на средах со значеннем а от 0,99 до 0,63. Потребности в доступной воде у бактерий, как правило, выше, чем у дрожжей и микроскопических грибов. Так, большинство бакте­рий, за исключением галофилов, хорошо растет на средах с вeличиной а от 0,99 до 0,95, минимальная величина а, обеспечивающая рост дрожжей, лежит в пределах от 0,91 до 0,88.

Активность воды в среде можно определить по формуле а=А/100, где А - относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равновесии в закрытом сосуде, содержащем среду. Paз­личную активность воды в питательной среде или субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль, или уравновешиванием небольшого объема среды с большим объемом раствора HSO или солей NaCl, KCl, КNО), имеющих определенную активность воды.

ГЛАВА 5

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Физиологию, биохимические свойства, циклы развития микроорганиз­мов исследуют, как правило, при работе с чистыми культурами. Чистой, или аксенической, культурой называют такую культуру, которая содер­жит микроорганизмы одного вида. Умение выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популяции, существующей в природе, и под­держивать чистоту культуры - необходимое условие работы с микроор­ганизмами. Выделение чистой культуры обычно включает три этапа: получение накопительной культуры; выделение чистой культуры; определение чистоты выделенной культуры.

ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований и М. Бейерин­ком. Сущность его заключается в создании элективных, т. е. избира­тельных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешан­ной популяции.

При создании элективных условий необходимо знать физиологию или четко представлять те особенности, которыми должны обладать вы­деляемые микроорганизмы. Элективные условия создают чаще всего, подбирая соответствующие среды, поскольку различные микроорганиз­мы для своего развития предъявляют неодинаковые требования к источ­никам питания. Например, микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут расти в среде, из состава которой исключены связанные формы азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного разнообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры автотроф­ных микроорганизмов получают на средах, где единственным источни­ком углерода служит углекислота. Отсутствие в среде других соедине­ний углерода задерживает развитие гетеротрофов. Такие специфичес­кие питательные среды, удовлетворяющие потребности преимуществен­но одной группы микроорганизмов, носят название элективных. В за­рубежной литературе большее распространение получили термины

«накопительные» или «селективные» среды.

Накопительные культуры микроорганизмов, обладающих высокой требовательностью к составу питательных сред, получают иначе. При их выделении используется неодинаковая чувствительность клеток сме­шанной популяции к продуктам обмена веществ, накапливающимся в среде. Примером могут служить молочнокислые бактерии, для накопле­ния которых используют солодовое сусло без мела, то есть среду, первона­чальнo не обладающую элективностью. После внесения природного ма­териала, содержащего молочнокислые бактерии, в среде вначале наря­ду с молочнокислыми бактериями хорошо развиваются представители родов Enterobacter и Escherichia. Однако по мере накопления в среде молочной кислоты и этилового спирта, образуемого гетероферментативными видами, условия для развития энтеробактерий и эшерихий постепенно ухудшаются, тогда как молочнокислые бактерии, которым свойственна высокая кислото - и спиртоустойчивость, продолжают расти. Таким образом, в результате развития молочнокислых бактерий среда приобретает необходимую степень элективности, что и обеспечивает по­лучение накопительной культуры этих бактерий. Другим примером мо­гут служить уксуснокислые бактерии, которые характеризуются высо­кой устойчивостью к этиловому спирту. Накопление этих бактерий осу­ществляют на сусле, к которому добавляют 4-5% этанола.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций в среду включают антибиотики, которые отличаются специфичностью действия и позволяют избирательно подавить рост определенной группы микроорганизмов. Так, элективные условия для развития грамотрица­тельных бактерий можно создавать внесением в среду пенициллина в концентрации от 0,2 до 100 мг/л, поскольку многие виды грамположи­тельных бактерий при этом или совсем не развиваются, или развиваются медленно. Чтобы создать благоприятные условия для развития бактерий и, напротив, подавить рост мицелиальных грибов, к средам рекомендуют добавлять нистатин в концентрации от 0,1 до 20 мг/л или гризеофульвин в концентрации от 1 до 20 мг/л.