Микробиология (стр. 22 )

Выделение чистой культуры

из одной клетки

Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельным ме­тодом с помощью микроманипулятора или микроселектора.

Капельный метод Линднера используют при работе с крупными микроорганизмами: дрожжами, мицелиальными грибами, водоросля­ми. Порядок работы следующий. Накопительную культуру разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле были оди­ночные клетки микроорганизмов. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат «висячая капля». Нане­сенные на покровное стекло капли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых обнаружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Через 12-24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в которых наблюдается образование микроколоний, осторожно снимают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор (рис. 54) - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. Микроманипулятор име­ет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влажная камера, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закреплены микропипетки (микропетли) , перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Микропипетки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в висячей капле. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой.

Рисунок 54. Микроманипулятор со скользящими плоскостями конструкции Рейнерта: 1 – нижняя пластина штатива, 2 – колонка, 3 – общая подставка для микроскопа и микроманипулятора, 4, 5 – скользящая пластина с рукояткой, 6 – штатив микроманипулятора для крепления держателя микроинструментов (7)

Выделение отдельных клеток с помощью микроселектора Перфиль­ева. Наиболее существенной частью микроселектора Перфильева явля­ется стеклянный микрокапилляр, имеющий строго прямоугольное сече­ние. Благодаря этому канал капилляра хорошо просматривается даже

с иммерсионным объективом. Стерильный капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток в агаризованной питательной среде и при большом увеличении микроскопа находят участок с одной клеткой. Специальным приспособлением этот участок капилляра стерильно вы­бивают в приемник, из которого затем переносят в стерильную среду. Микроселектор Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так и мелких микроорганизмов.­

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ

Чистота выделенной культуры микроорганизмов должна быть тща­тельно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способа­ми - визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд пи­тательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микро­организмов по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред.

Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролиро­вать под микроскопом. Для этого следует приготовить препарат фикси­рованных окрашенных клеток и просмотреть его с иммерсионной систе­мой или препарат живых клеток и просмотреть его, используя фазово - ­контрастное устройство. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однородна; допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако необходимо помнить, что клет­ки некоторых бактерий, например, микобактерий, нокардий и др., очень полиморфны, поэтому определение частоты таких культур при микроскопировании вызывает некоторые затруднения. Чистоту культур мик­роорганизмов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Прежде всего выделенную культуру высевают на плотную среду, бла­гоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний - свиде­тельство чистоты культуры. Обязателен посев на мясо-пептонный агар - среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или, напротив, отсутствие роста, если данные микроорганизмы на мясо - ­пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключе­ние о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на МПА. Особенно это касается авто­трофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом еще на ряд сред - ­сусло, мясо - пептонный бульон, картофельный агар и др. Набор сред и их состав определяются особенностями метаболизма выделенных микро­организмов, а также их возможных спутников.

ЧАСТЬ 2

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ.

1.1.  Цель работы: ознакомление с устройством микроскопа и приобретение навыков приготовления препаратов живых микроорганизмов.

1.2.  Общие сведения

Микроскоп – это оптический прибор для получения увеличенных изображений очень малых предметов. Современными моделями биологического микроскопа являются микроскопы серии «Биолам».

Микроскоп состоит из оптической системы и механической части. Оптическая система предназначена для увеличения изображения предмета. Она включает увеличительную ( объектив и окуляр) и осветительную ( зеркало и конденсор с ирисовой диафрагмой и откидной линзой) системы.

Объектив представляет собой систему линз, заключенных в трубку. В микроскопах «Биолам» используются объективы с увеличением х3, х5, х8,х10, х20, х40, х60, х85, х90. Объективы малого увеличения применяют для предварительного просмотра препарата, объективы среднего увеличения( х20, х40,х60) - для изучения крупных клеток микроорганизмов, объективы большого увеличения (х85,х90) – иммерсионные - для изучения внутренних структур клеток. Объективы бывают сухие и погружные ( иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объективом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает работу с ними при погружении фронтальной линзы объектива в однородную жидкую среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха (1) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя.

При работе с иммерсионным объективом между покровным стеклом и линзами объектива помещают кедровое (касторовое) масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла. Лучи в оптически однородной гомогенной среде не меняют направления.

Окуляр служит для увеличения изображения, полученного от объектива.

Окуляры обычно имеют увеличение х7, х10, х15. Увеличение объектива и окуляра указано на их оправе.

Основными характеристиками объектива являются фокусное расстояние и разрешающая способность. Фокусное расстояние в отечественных микроскопах выражается в миллиметрах и, чем оно меньше, тем больше увеличение. Разрешающая способность объектива, то есть способность изображать мельчайшие детали препарата, определяется наименьшим расстоянием, при котором два близко расположенных штриха видны раздельно. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений окуляра и объектива.

Осветительное устройство состоит из зеркала и конденсора. Зеркало имеет плоскую и вогнутую отражающие поверхности. Обычно при работе зеркало повернуто к свету плоской стороной. Конденсор состоит из двух линз. Линзы собирают параллельные лучи света, отраженные от зеркала, в один пучок в плоскости исследуемого препарата. Конденсор укреплен на кронштейне и может передвигаться вверх и вниз с помощью рукоятки. На нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, с помощью которой регулируют интенсивность освещения препарата.

Пучок лучей от источника света попадает на зеркало, отражается через диафрагму конденсора, проходит через нее, через исследуемый препарат и попадает в объектив. Объектив дает увеличенное изображение препарата в плоскости окуляра.

Механическая часть микроскопа состоит из основания и тубусодержателя, на котором укреплены предметный столик, кронштейн конденсора и зеркало. В верхней части расположены головка для насадки с окуляром и револьвер с объективами. Предметный столик служит для закрепления на нем исследуемого препарата.

Фокусировка осуществляется при перемещении тубуса с помощью механизма, приводимого в движение двумя винтами – макрометрическим ( грубая настройка) и микрометрическим ( тонкая настройка). Качество микроскопа определяется его увеличительной и разрешающей способностями. Теоретически микроскоп может дать увеличение 2000х раз и более. Однако следует различать полезное и бесполезное увеличение микроскопа. Пределы полезного увеличения в обычно используемых микроскопах достигают 1400х. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света, которые незаметны в пределах полезного увеличения, но приводят к оптическим ошибкам в зоне бесполезных увеличений. Разрешающая способность микроскопа определяется главным образом объективом и конденсором.

1.3.Практическая часть.

1.3.1.Знакомство с правилами работы с микроскопом.

Сначала ставят объектив с малым увеличением (х8) и при этом увеличении устанавливают наилучшее освещение. Наилучшее освещение достигается при регулировке положения зеркала, конденсора и диафрагмы. При просмотре неокрашенных препаратов применяют суженную диафрагму и опущенный конденсор. При наблюдении окрашенных препаратов - открытую диафрагму и поднятый конденсор.