Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 10 )

16. Измерить величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Измерение ОП содержимого лунок планшета необходимо произвести в течение 15 мин после внесения стоп-реагента.

17. Строим график зависимости оптической плотности от концентрации GDNF в калибровочном растворе. По калибровочному графику определяем концентрацию GDNF в образцах.

Обсуждаем полученные результаты, делаем вывод о содержании GDNF в сыворотке крови.

Заключение

Иммунохимические методы анализа нашли широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности. Они успешно применяется для изучения различных тканевых и сывороточных маркеров:

• массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);

• выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;

• определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

• выявления иммунных комплексов;

• выявления онкомаркеров;

• определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);

• определения общего IgE и специфических IgE антител;

• скрининга моиоклональных антител;

• определения цитокинов в биологических жидкостях.

В иммунохимических методах сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения флюоресцентной или ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Отдельные иммунохимические методики позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Их средняя чувствительность – 10-9-10-12 моль.

Список литературы

1.  Угрюмов методы иммуноцитохимии и гистохимии. М. 1991. С. 115.

2.  , , Сухорукова маркеры используемые при дифференцировки стволовых клеток // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. № 3. Т. 5.

3.  , Гиляров , 2007, т.131 , №2, с.75-76 .Морфология, 2007, т.131 , №2, с.75-76 .Ядерный белок NeuN в амилоидных тельцах головного мозга человека // Морфология. 2007. №2. Т.131. С.75-76.

4.  Подгорный и поведение нейральных стволовых клеток человека в культуре ткани и при трансплантации в головной мозг крыс - диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. 2006. С. 171.

5.  , , Александрова нейроэпителиальных структур в культуре нейральных стволовых клеток мозга человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. № 3. С. 131-135.

6.  История имуноцитохимии. Обзорная статья. Электрон. текст. дан. Режим доступа: http:// www. biovitrum. ru, свободный.

7.  Разведение антител в иммуноцитохимии. Хранение и использование антител. Электрон. текст. дан. Режим доступа: http:// , свободный.

8.  Хериет, Гаттер. Иммуноцитохимия: световая микроскопия // Электрон. текст. дан. Режим доступа: http:// www. histopathology. narod. ru, свободный.

9.  Всероссийская научная школа для молодых ученых «Современные методы флуоресцентной визуализации в биомедицинских и биотехнологических исследованиях» Электрон. текст. дан. Режим доступа: http://cor. ru, свободный.

10.  Кишкун исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство. 2009.

11.  Кондратьева по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗов. Академия. 2004.

12.  К., ИФА-диагностика сифилиса Информационно-методическое пособие. 2005. Режим доступа: http://www. vector-best. ru/publ/doc/9607.pdf, свободный.

13.  Вербов твердофазного иммуноферментного анализа.- Твердофазный иммунный анализ. Сборник научных трудов, Л., Изд. института им. Л. Пастера, том 64, 1998. С 3-27.

14.  Лекции ассоциации специалистов лабораторной диагностики Иркутской области. Режим доступа: http://asld. baikal. ru, свободный.

Список используемых сокращений

АГ - антитен

АТ - антитело

IgG - иммуноглобулин класса G

БСА - бычий сывоторочный альбумин

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ГА - глютаровый альдегид

ФА - формальдегид

ПФА - парафармальдегид

ЭГС - этилен гликоль-бис-сукцинимидил сукцинат

Содержание

Введение 3

Занятие 1. Основные принципы иммунохимических методов (семинар) 4

Контрольные вопросы 10

Занятие 2. Иммуногистохимия.

Основные этапы проведения иммуногистохимических исследований 11

Лабораторная работа №1 "Иммуноцитохимическое маркирование нейронов и астроцитов в культуре клеток" 13

Контрольные вопросы 15

Занятие 3. Подготовка образца (фиксация образца, демаскирование антигена) 16

3.1. Фиксация 16

3.2. Демаскирование антигена 19

Лабораторная работа №2 "Влияние различных фиксаторов на морфологическую сохранность образца" 21

Контрольные вопросы 23

Занятие 4. Визуализация полученных результатов 24

4.1. Флюорохромы 24

4.2. Ферментные метки 24

4.3. Металлы и металлопротеиды 29

4.4. Радиоизотопы 29

Занятие 5. Контроль специфичности иммуноцитохимического окрашивания 30

5.1. Постановка позитивных и негативных контролей 30

5.2. Блокировка неспецифического связывания 31

5.3. Выбор антител 31

Лабораторная работа №3 "Постановка негативных контролей неспецифического окрашивания" 34

Контрольные вопросы 36

Занятие 6. Иммуноферментный анализ 37

6.1. Основные принципы иммуноферментного анализа 37

6.2. Характеристика компонентов, используемых в ИФА. 40

Ферменты 40

Контрольные вопросы 43

Лабораторная работа №4 «Знакомство с оборудованием. Приготовление рабочих растворов для проведения иммуноферментного анализа» 45

Занятие 7. Варианты постановки ИФА. 46

«Сэндвич» метод иммуноферментного анализа 46

Лабораторная работа №5 «Определение нейротрофического фактора головного мозга в сыворотке крови» 50

Занятие 8. Системы усиления сигнала. Авидин-биотиновый комплекс 53

Лабораторная работа №6 «Определение концентрации GDNF в сыворотке крови» 54

Заключение 58

Список используемых сокращений 61

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И ТКАНЕЙ

Составители:

Мария Валерьевна Ведунова

Наталья Александровна Щелчкова

Учебно-методическое пособие

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Нижегородский государственный университет

им. »

603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

Подписано в печать. Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс.

Усл. печ. л. . Уч.-изд. л. .

Заказ. Тираж 70 экз.

Отпечатано в типографии Нижегородского

госуниверситета им.

603600, г. Нижний Новгород, ул. Большая Покровская, 37