Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 6 )

Таблица 2

Пример информационного листа, предоставляемого производителями антител

Product Name (название продукта)	Anti-GFAP antibody - Astrocyte Marker (анитела выработанные против глиального фибрилярного кислого белка - маркера астроцитов)
Product type (тип антител)	Primary antibodies (первичные антитела)
Description (описание)	Chicken polyclonal to GFAP - Astrocyte Marker (куриные полилональные антитела к глиальному фибрилярному кислому белку - маркеру астроцитов)
Immunogen (к каким эпитопам получены антитела)	Указано, что данные антитела получены ко всем антигенным детерминантам глиального фибрилярного кислого белка (коров) Full length native protein (purified from a Triton X-100 extract of myelin associated material, further purified by centrifugation and ion exchange chromatography in 6m urea on DEAE cellulose) (Cow).
Reacts with (реагирет с...)	Hu, Ms, Rat, Cat, Chk, Cow, RMk Мышь (то есть данные антитела реагирует с глиальным фибрилярным кислым белком мыши)
Predicted to react  (прогнозируемое реагирование)	Mamm (Due to sequence homology) Все млекопитающие (производитель прогнозирует, что данные антитела будут реагировать с глиальным фибрилярным кислым белком всех млекопитающих, однако данных по реагированию данных антител с белком животных не включенных в предыдущий раздел у него нет)
Tested applications (методы, в которых протестированны данные антитела)	ICC/IF, IHC-FoFr, IHC-Fr, IHC-P, WB Иммуноцитохимия/иммунофлюорисценция

Информации о продукте производители сопровождают иллюстрированным материалом, который поможет исследователю, если он впервые проводит окраску по данному антигену и не знает, какой результат является ожидаемым.

Поскольку данные антитела куриные, то вторичные антитела должны быль соответственно к константному домену куриных иммуноглобулинов. Если мы планируем двойное окрашивание, то первичные антитела ко второму антигену не могут быть куриными, иначе при окрашивании вторичными антителами они прореагируют с обоими типами первичных антител и будет невозможно провести дифференциальную диагностику антигенов.

Лабораторная работа №3 "Постановка негативных контролей неспецифического окрашивания"

Одним из самых больших недостатков иммунологических методов исследования является возможность получения ложноположительного или ложноотрицательного результата. Появление ложноотрицательного результата возможно, когда по тем или иным причинам не произошла реакция связывания антиген - антитело. Это может быть следствием разрушения антигенных эпитопов в процессе проведения анализа или за счет недоступности антигена для антитела. Часто исследователь заранее знает, что в образце имеется искомый антиген, для него важна локализация и количество антигена, в этом случае нет необходимости проведения позитивного контроля. Постановка негативных контролей необходима всегда. В случае использования флюорисцентного иммуноцитохимического окрашивания необходима постановка двух контролей, поскольку кроме неспецифического связывания антител, существует проблема автофлюорисценции.

Цель работы: постановка отрицательных контролей для определения неспецифического связывания и автофлюорисценции.

Оборудование: см. лабораторную работу №1.

Реактивы:

1. Полифосфатный буфер (или раствор Хенкса).

2. Формалин 4%: 40% формалин разводят полифосфатным буфером в соотношении 1 к 9.

3. Детергент: 0,03% раствор тритонХ100 в полифосфатном буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) или 3% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

4. Раствор первичных антител. Куриные антитела к GFAP разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1 к 400. Мышиные антитела к NeuN разводят в соотношении 1 к 150. В раствор антител вносят 1% БСА или 3% ЭТС.

5. Раствор вторичных антител. Антитела против константных доменов куриных антител меченные флюорисцентным красителем Cy5 разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1 к 200. Антитела против константных доменов мышиных антител меченные флюорисцентным красителем Alexa 488 разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1 к 200.В раствор антител вносят 1% БСА или 3% ЭТС.

Ход работы:

1. Полностью убрать культуральную среду.

2. Диссоциированную культуры промыть 2 раза по 5 минут полифосфатным буфером.

3. Зафиксировать культуру 4% формалином на 5-10 минут. После фиксации фиксатор убирать.

4. Промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

5. Добавить раствор детергента для проведения демаскирования антигенных детерминант (30 минут). При проведении демаскирования необходимо контролировать морфологическую целостность культуры в световой микроскоп.

6. После окончания процедуры демаскирования промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

7. Одну культуру обработать только раствором первичных антител.

Вторую не обрабатывать первичными антителами, а сразу добавить раствор вторичных антител.

8. Образец инкубировать с раствором антител в течение 2-3 часов при комнатной температуре или 12 часов при температуре (+4-+60С).

9. После окончания инкубации исследуемый образец промытьполифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

10. На флюорисцентном (конфокальном) микроскопе визуально оценить флюорисценцию Су5 и Alexa 488. Образец №1 не обрабатывался раствором вторичных антител, конъюгированных с флюорисцентной меткой, соответственно появление флюорисценции свидетельствует об автофлюорисценции. Интенсивность автолюорисценции зависит от используемого фиксатора и природа самого образца. В образец №2 не добавлялись первичные антитела, то есть в образце нет центров связывания для вторичных антител, специфичных к константным доменам первичных антител. Появление флюорисцентного сигнала сильнее, чем уровень автофлюорисценции, свидетельствует о неспецифическом взаимодействии вторичных антител и необходимости модификации протокола исследования.

Контрольные вопросы

1.  Поясните необходимость постановки положительных и отрицательных контролей для оценки специфичности иммунногистохимического связывания.

2.  Объясните необходимость проведения процедуры блокировки неспецифического связывания.

3.  Перечистите основные параметры, используемые при выборе коммерческих антител для проведения исследовательской работы.

Занятие 6. Иммуноферментный анализ

6.1. Основные принципы иммуноферментного анализа

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунохимический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Иммуноферментный анализ – комплексная методика, которая сочетает в себе чувствительность иммунной реакции и активность ферментативной. Иммунная реакция осуществляет связывание искомого вещества (белка, части клетки или микроба), а ферментативная позволяет перевести результат иммунной реакции в форму доступную для измерения оптическими приборами.

Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса.

Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент, называется субстратом. В результате взаимодействия субстрата и фермента происходит образование другого вещества – продукта реакции. Фермент может действовать только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.

Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10. При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Вычисление концентрации вещества по окрашенному раствору осуществляют методои – колориметрия.

В основном для проведения ИФА исследуемым биологическим материалом является кровь, однако, исследованию может подвергаться спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела, околоплодные воды и др.

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1) стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2) стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;