Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 1 )

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Нижегородский государственный университет им.

Национальный исследовательский университет

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И ТКАНЕЙ

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ННГУ, обучающихся по направлению 020400.62 «Биология», по профилю "Биофизика"

Нижний Новгород

2013

УДК 57.083.3 (075.8)

ББК Р252.325 (01 я73)

И 53

И 53 ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ И ТКАНЯХ. Составители: Ведунова М. В., Щелчкова Н. А.: Учебно-методическое пособие. − Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет им. , 2013. – 64 с.

Рецензент: проф., д. б.н.,

Методическое руководство содержит краткие теоретические сведения по различным иммунохимическим методам, применяемых в современной аналитической практике прикладных и фундаментальных отраслей биомедицины.

Руководство предназначено для студентов 4 курса дневного отделения, обучающихся по направлению подготовки "Биология", по профилю "Биофизика" в рамках проведения практических работ по курсу "Нейрональные сети".

Ответственный за выпуск:

председатель методической комиссии

биологического факультета ННГУ,

д. п.н., профессор

УДК57.083.3 (07.7)

ББК Р252.325 (Р)

© Нижегородский государственный

университет им. , 2013

Введение

Иммунохимические методы исследования основаны на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Эти методы широко используются для  лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных заболеваний, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений, в научно-исследовательской работе. Применение антител лежит в основе исследований структурных компонентов клетки, клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов), рецепторов на клеточной поверхности и так далее.

Индикация образующегося комплекса антиген-антитело осуществляется, введением метки, которая детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых обеспечивает максимальную чувствительность анализа.

Современными методическими направлениями, основанными на принципах взаимодействия АТ-АГ, являются: иммуногистохимия, иммуноферментативный анализ.

Иммуногистохимия — это метод выявления точной локализации того или иного клеточного или тканевого компонента (антигена) in situ благодаря связыванию его с мечеными антителами.

Иммуноферментный анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.

Основной целью создания нашего методического пособия является формирование развернутых и современных представлений о диагностических возможностях и методах, основанных на механизмах функционирования иммунной системы. В органической связи с получением фундаментальных знаний по данной проблеме важной частью работы является формирование практических навыков выполнения исследований на основе принципа взаимодействия АТ-АГ, постановка опыта, регистрация и интерпретация результатов.

Занятие 1. Основные принципы иммунохимических методов (семинар)

В основе всех иммунохимических методов исследований лежит реакция взаимодействия антитела и антигена. Антиген (antigen = antibody-generating — «производитель антител») — это любое чужеродное вещество. По химической природе это могут быть - высокомолекулярные белки и полисахариды, реже полипептиды, липиды и нуклеиновые кислоты. Например, для нашего организма антигеном будут являться различные молекулы бактериальной стенки, а белки мышиной крови будут выступать в качестве антигена при введении их кролику, белки плода являются антигенами для организма матери. Проникновение АГ в ткани восприимчивого организма вызывает развитие иммунного ответа. Его формирование связано с синтезом специфических антител, которые затем связываются с чужеродным агентом. Та часть молекулы антигена, которая соединяется с антителом, называется эпитопом или антигенной детерминантой. Биологические объекты, которые состоят из множества макромолекул, например бактерии, содержат большое количество эпитопов, что определяет разнообразие антител, специфичных данному объекту.

Антитела (antibody) – особый класс гликопротеинов, синтезируемый лимфоидной тканью. На электрофореграмме они формируют γ-глобулиновую белковую фракцию плазмы, поэтому получили название иммуноглобулины. У млекопитающих выделяют пять классов антител (иммуноглобулинов) – IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, различающихся между собой по строению и аминокислотному составу тяжёлых цепей и по выполняемым эффекторным функциям.

Наиболее распространен класс иммуноглобулинов G (IgG). Он составляет около 75-80% всех иммуноглобулинов и 10-20% общего белка сыворотки крови, синтезируется зрелыми В-лимфоцитами. Молекула IgG состоит из двух субъединиц, соединенных дисульфидными связями (рис. 1). В молекуле иммуноглобулина выделяют следующие области: Fc-фрагмент (constant fragment – константный домен) и Fab-фрагмент (antibody fragment – антигенсвязывающий, вариабельный домен).

Структура константного домена идентична для всех молекул IgG у определенного вида животных. Таким образом, Fc-фрагмент определяет видоспецифичность антител и не участвует во взаимодействии антитела с антигеном. Структура антигенсвязывающего домена крайне вариабельна, этот домен определяет специфичность антител, поскольку участвует во взаимодействии с эпитопом антигена. Каждая молекула IgG имеет в своем составе два вариабельных фрагмента, то есть может соединяться с двумя различными антигенными детерминантами. Если антиген поливалентен (например, белок), то в сыворотке крови образуются антитела, обладающие разной специфичностью связывания антигена. Такие антитела – поликлональные. Поликлональные антитела гетерогенны как по структуре антигенсвязывающего центра, так и по физико-химическим свойствам. Первичные антитела являются поликлональными.

Pис. 1. Схема строения антител (иммуноглобулина G)

Иммуноглобулины являются макромолекулами и сами могут выступать в роли антигенов. При введении иммуноглобулинов в организм животного другого вида получают антитела к константному домену. Поскольку Fc-фрагмент видоспецифичен, то полученные антитела являются специфичными ко всем возможным иммуноглобулинам данного вида животного. Таким способом получают «вторичные антитела». Вторичные антитела, комплементарные Fc-фрагменту IgG будут моноклональными.

Антитела с одной специфичностью связывания –моноклональные.

Поликлональные антисыворотки, получаемые при иммунизации животных, содержат АТ к различным эпитопам антигена (АГ). Для получения поликлональной антисыворотки лабораторному животному вводят очищенный АГ вместе с неспецифическим стимулятором иммунного ответа – адъювантом. АГ стимулирует множество В-лимфоцитов, каждый из которых дает клон плазматических клеток, продуцирующий АТ. АГ может иметь несколько эпитопов и антисыворотка содержит иммуноглобулины против каждого из них, причем каждый клон плазматических клеток способен вырабатывать АТ лишь к одному типу эпитопов.

Процесс получения поликлональных антител включает несколько последовательных стадий:

1. Выделение антигена.

2. Иммунизация животного (ввод в организм животного антигена).

3. Выработка антител в организме животного (часто для полноценного иммунного ответа и выработки достаточного количества антител необходима повторная иммунизация).

4. Получение сыворотки крови иммунизированного животного.

5. Выделить интересующие нас антитела.

Моноклональные антитела получают методом гибридомной технологии. В 1975 году Кехлер и Милстеин разработали гибридомную технологию, которая основана на слиянии (гибридизации) миеломных клеток со спленоцитами иммунизированных животных. Такой подход дал возможность получать разнообразные моноклональные антитела в больших количествах. В организме в процессе развития иммунного ответа формируется пул клеток, каждая из которых производит анитела к одному эпитопу (антигенной детерминанте), в результате в организме появляется множество антител к разным эпитопам одного антигена. Гибридомная технология позволяет получать огромное количество антител к одному эпитопу антигена. Гибридома, обладая способностью к неограниченному делению, способна постоянно продуцировать узко специфичные антитела. В настоящее время создана только мышиная гибридома, то есть на данный момент существуют только мышиные моноклональные антитела. Несмотря на то, что их получение многоэтапное и сложное, они, являются высокоспецифичными. Гомогенность моноклональных антител делает более предсказуемой концентрацию антител, что обеспечивает более высокую воспроизводимостью результатов, а высокая специфичность обеспечивает идентификацию антигена в смеси похожих по структуре антигенов. Однако моноклональные антитела имеют свои недостатки: