Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 8 )

2.  Классификации иммуноферментного анализа.

3.  Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

4.  Ферменты. Антитела и Антигены. Конъюгат. Твердая фаза.

Лабораторная работа №4 «Знакомство с оборудованием. Приготовление рабочих растворов для проведения иммуноферментного анализа»

Цель работы - познакомиться с техникой работы и программным обеспечением микропланшетного спектрофотометра, вошера, инкубатора шейкера. Приготовить рабочие разведения реактивов.

Оборудование:

1. Инкубатор - Шейкер микропланшетного формата.

2. Вортекс.

3. Вошер.

4. Микропланшетный спектрофотометр Еpoch для УФ-спектроскопии и спектроскопии в видимой области для микропланшет.

5. Термостат.

Освоить технику работы на микропланшетном спектрофотометре Еpoch, познакомиться с программным обеспечением GEN 5, создать протокол метода ИФА.

Необходимые реагенты:

1. Phosphate Buffered Saline (PBS).

2. Bovine Serum Albumin, FactionV, Protease free.

3. Твин 20.

4. Substrat solution H2O2: Тетраметилбензидин (ТМБ).

Приготовленные реактивы хранятся при температуре 2-8ºС.

Занятие 7. Варианты постановки ИФА.

«Сэндвич» метод иммуноферментного анализа

Общий принцип.

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура отмывки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наиболее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может производиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли - или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела – конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и индикатор. Освободившийся фермент расщепляет субстрат, реакционная смесь окрашивается в желто-коричневый цвет, если в качестве субстрата для пероксидазы используется перекись водорода или в желто-зелёный, если метка осуществлялась щелочной фосфотазой. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Иммуноферментный анализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА.

В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой. Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

I. Сорбция антигена.

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка.

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.

III. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфических антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000).

Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется тетраметилбензидин (ТМБ). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ТМБ.

Раствор субстрата: 30% перекись водорода и ТМБ 1:1

Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

IV. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 2 N Н2SО4.

В лунки с рабочим раствором ТМБ после инкубации вносят по 50 мкл раствора 2 N серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

V. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=450 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата.

Лабораторная работа №5 «Определение нейротрофического фактора головного мозга в сыворотке крови»

Зрелая молекула BDNF млекопитающих имеет м. м. 13 кДа и состоит из 119 аминокислотных остатков. BDNF экспрессируется в фибробластах, астроцитах, нейронах различного фенотипа и локализации, мегакариоцитах/тромбоцитах, шванновских клетках (в районах повреждения) и, возможно, в клетках гладкой мускулатуры. BDNF в плазме обнаруживается в количествах порядка пг/мл, в то время как в сыворотке он присутствует в количествах порядка нг/мл. Разница обуславливается высвобождением BDNF при дегрануляции тромбоцитов и свертывании крови. Функциональная активность BDNF довольно велика. В период развития он участвует в дифференцировке нейронов, созревании, выживании и формировании синапсов. Во взрослом организме основная функция BDNF – нейропротекция, защита нейронов головного мозга от ишемических атак и мотонейронов от гибели, индуцируемой удалением аксонов.

Сегодня на рынке представлено огромное количество различных наборов для ИФА. Наборы иммунохимических реагентов для определения антигенов называются диагностикумами. Они содержат утвержденную характеристику метода с учетом данного уровня достоверности и являются гарантом качества проводимых исследований.

Цель работы – освоить иммуноанализ сэндвич-типа. Определить концентрацию нейротрофического фактора в сыворотке крови (набор R&D System Kit Elise № DBD00) .

Оборудование: Шейкер BioSan Thermo-Shaker TS-100, вортекс BioSan, микропланшетный спектрофотометр BioTek Еpoch, термостат, пипетка автоматическая Transferpette 1-10 мкл, пипетка автоматическая Transferpette 10-100 мкл микро, пипетка автоматическая Transferpette 100-1000 мкл, Пипетка автоматическая многоканальная Transferpette 100-300 мкл.

Расходные материалы: Нестерильные наконечники для дозатора (Biohit), 1-10 мкл нестерильные наконечники для дозатора (Biohit), 300 мкл нестерильные наконечники для дозатора (Biohit), 1000 мкл, штатив для пробирок на 96 мест ИФА, ванночки пластиковые одноразовые для ИФА, клейкие пластинки на планшет для инкубации Adhesive Strip (For 96 wells), полистироловые EIA стрипы Costar EIA Plate высокой сорбции, с сорбированными на них АТ к BDNF, полипропиленовые пробирки 1,5 мл, 5 мл.