Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 5 )

Методы, связанные с выявлением активности щелочной фосфатазы, основаны на использовании искусственных субстратов (фосфаты нафтолов) с добавлением в инкубационную среду солей диазония. Локализация фермента после гидролиза субстрата становится видимой в результате образования из солей диазония нерастворимых азокрасителей. Щелочная фосфотаза это целая группа ферментов широко распространенных в тканях млекопитающих, активность большинства представителей этой группы блокируется добавлением левамизола. Левамизол не блокирует только кишечную и плацентарную фракцию щелочной фосфатазы, поэтому для этих тканей лучше использовать другие ферменты.

Глюкозоксидаза может использоваться без ограничений при окраске любых тканей, так как в тканях млекопитающих нет такого фермента.

Использование ферментных меток сделало иммуноцитохимические методы общедоступными. Однако ферментные методы малоэффективны при работе с антигенами, которые содержатся в небольших количествах (такими как рецепторы, ионные каналы, транскрипционные факторы). Для увеличения эффективности ферментных методов используются различные методы усиления сигнала.

Использование антител против пероксидазы или щелочной фосфатазы (рис. 7).

Рис. 7. Схема окрашивания с использованием антител против фермента

Процедура такого окрашивания включает несколько

последовательных стадий:

• обработка первичными антителами;

• обработка вторичными антителами, которые одним активным центром связываются с константным доменом первичных антител, а второй, остается свободным;

• добавление третьих антител против фермента. Третьи антитела того же вида животного, что и первичные. Второй центр связывания вторичного антитела реагирует с константным доменом третьих антител против фермента;

• добавление фермента и буферных растворов для активации работы фермента и накопления окрашенного продукта реакции.

Таким образом, использование антител против фермента позволило в 2 раза увеличить чувствительность метода.

Расширенное полимерное одностадийное окрашивание (Enchanced Polymer One Step staining - EPOS) – метод, в котором для увеличения чувствительности ферментного метода используются полимерные макромолекулы, конъюгированные с антителами (рис. 8).

Рис. 8. Схема расширенного полимерного одностадийного окрашивания

Кроме одностадийного расширенного полимерного окрашивания используется и двухэтапный метод, в котором с полимером конъюгированы вторичные антитела. Использование расширенного полимерного окрашивания позволяет многократно усилить сигнал.

В 1979 году была впервые применена для иммуноцитохимического окрашивания биотин-авидиновая система. Этот метод получил название АВС-метод (Avidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex). Применением биотин-авидинового комплекса позволило увеличить чувствительность иммунохимического окрашивания. Авидин имеет 4 центра связывания и образует прочный комплекс с биотином. Биотин образует устойчивые комплексы с белками, в том числе с антителами (рис. 9).

Биотин-авидиновый комплекс состоит из антитела, которое через биотин связан с авидином, у которого остается 3 свободных центра для связывания флюорохрома или фермента. Недостатком АВС-метода является то, что авидин реагирует с эндогенным биотином, лектином и заряженными группами других молекул эндогенного происхождения.

Рис. 9. Схема вторичного антитела после реакции с биотин-авидин-ферментным комплексом

В результате использование авидин-биотиновой системы сопровождается большим фоновым уровнем накопления окрашенного продукта ферментативной реакции.

Замена авидина на стрептавидин позволила резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода приблизительно в 8 раз. Стрептовидин белок, который получают из микроорганизма Streptomyces avidinii – он хорошо связывается с биотином, но не имеет заряда в нейтральной среде и не связывается с другими молекулами, кроме того его сродство с эндогенным биотином ниже, чем у авидина.

Увеличить чувствительность метода позволило применение декстрановых систем. На одну молекулу декстрана сажают до 20 молекул антител (первичных или вторичных – в зависимости от того прямое или не прямое окрашивание используется) и до 100 молекул фермента. Таким образом, одна молекула антигена макрируется с помощью 100 молекул фермента, что обеспечивает крайне высокую чувствительность.

Еще более чувствительными оказываются системы с амплификацией, основанные на тирамиде. Вторичные антитела конъюгированы с стрептовидин-биотиновой-пероксидазной системой. Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в исследуемом образце около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз. Данный метод позволяет обнаружить даже антигены с очень низкой экспрессией. Одна чувствительность метода заметно страдает из-за эндогенного биотина. Замена биотина на флюоресцеин, а стрептавидин-пероксидазного комплекса на антитела против флюоресцеина, меченные пероксидазой хрена, полностью ликвидирует неспецифическое окрашивание. Чувствительность метода при этом не страдает, но специфичность возрастает многократно.

4.3. Металлы и металлопротеиды

Частицы коллоидного золота связанные с пероксидазной меткой, обладают высокой электронной плотностью и благодаря своей дискретности не затеняют лежащие ниже структуры, маркированные антителом. Они могут быть разного размера, что облегчает двойное мечение. Кроме того, меченные золотом образцы стабильны. Наиболее часто этот металл используется для иммуноцитохимического окрашивания в электронной микроскопии.

4.4. Радиоизотопы

После обработки образца антителами с радиоактивными метками по степени излучения можно судить о количестве искомого антигена в тканях. Меченные радиоактивными метками антитела в данный момент используются только для исследований на живых культурах клеток.

Занятие 5. Контроль специфичности иммуноцитохимического окрашивания

5.1. Постановка позитивных и негативных контролей

При проведении иммуноцитохимического исследования необходима постановка позитивных и негативных контролей.

1. Негативный контроль.

Проведение полного протокола иммуноцитохимического исследования без добавления первичных антител. Появление окраски в образце без добавления первичных антител говорит о наличии неспецифического связывания молекул образца с вторичными антителами и необходимости изменения протокола блокирования неспецифического связывания.

Для флюорисцентной иммуноцитохимии необходимо проведение дополнительного отрицательного контроля:

Проведение полного протокола иммуноцитохимического исследования без добавления вторичных антител. Появление флюорисценции в образце без антител конъюгированных с флюорохромом говорит о наличии автофлюорисценции. Как правило, автофлюорисценция связанна с применением фиксаторов, образующих ковалентные связи между молекулами, однако все биологические объекты автофлюорисцируют за счет присутствия ароматических аминокислот в составе белков, но уровень такой автофлюорисценции гораздо ниже чем после обработки «крослинкерами»

Существует несколько способов борьбы с автофлюорисценцией:

• выбор флюорохромов флюорисценция которых не связанна с низковолновой областью автофлюорисценции;

• выжигание автофлюорисценции (может повредить ангенные детерминанты).

• использование аппаратных настроек микроскопа для разделения автофлюорисценции и флюорисценции флюорохрома по уровню флюорисценции.

2. Позитивный контроль.

Проведение иммуноцитохимического окрашивания в образце, содержащем исследуемый антиген.

5.2. Блокировка неспецифического связывания

Антитела способны неспецифически связываться с белками образца и стенками посуды, в которой проводится неспецифическое окрашивание. Существует несколько способов уменьшить неспецифическое окрашивание.

1. Использование моноклональных антител.

2. Использование как можно более сильные разведения поликлональных антител. Для работы с такими разведениями необходима длительная инкубация срезов с антителами (например, в течение ночи).

3. Для разведения антител используют фосфатные буферы, содержащие около 0,1% инертного белка, например БСА (свободная от глобулинов фракция), который будет конкурировать с антителами за места неспецифического связывания.

4. Для блокирования неспецифического связывания предварительно проинкубируют препараты с неиммунной сывороткой животного - хозяина вторичных антител.

5.3. Выбор антител

В настоящее время большинство исследователей пользуются коммерческими антителами. Для подбора антител необходимо внимательно изучить информацию, которые предоставляют производители антител. В таблице 2 приведен пример коммерческой информации, предоставляемой производителями, для выбора антител.

Кроме иллюстраций и рекомендованного протокола окраски производитель часто размещает ссылки на научные публикации, в которых использовались данные антитела. Используя данные, предоставляемые производителем можно сделать вывод, что данные первичные антитела подходят для иммуноцитохимического окрашивания мышиного глиального фибрилярного кислого белка, который является маркером астроцитов.