Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 3 )

Оборудование: Автоматические пипетки с переменным объемом на 1-10мкл, 100-200 мкл, 100-1000 мкл. Темная камера. Флюорисцентный микроскоп. Световой микроскоп.

Реактивы:

1. Полифосфатный буфер (или раствор Хенкса).

2. Метанол (охлажденный -200С).

3. Детергент: 0,03% раствор тритонХ100 в полифосфатном буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) или 3% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

4. Раствор первичных антител. В его состав входят - куриные антитела к GFAP, которые разводят в полифосфатном буфере в соотошении 1 к 400; мышиные антитела к NeuN, которые разводят в соотношении 1 к 150. В раствор антител вносят 1% БСА или 3% ЭТС.

5. Раствор вторичных антител. В его состав входят - антитела против константных доменов куриных антител, меченные флюорисцентным красителем Cy5, которые разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1 к 200; антитела против константных доменов мышиных антител, меченные флюорисцентным красителем Alexa 488, которые разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1 к 200. В раствор антител вносят 1% БСА или 3% ЭТС.

Ход работы:

1. Полностью убрать культуральную среду.

2. Диссоциированную культуры промыть 2 раза по 5 минут полифосфатным буфером.

3. Зафиксировать культуры ледяным метанолом на льду. Время фискации 10 секунд. После фиксации метанол убирать.

4. Промыть полифосфатным буфером в 3 раза по 5 минут.

5. Добавить раствор детергента для проведения демаскирования антигенных детерминант (30 минут). При проведении демаскирования необходимо контролировать морфологическую целостность культуры в световой микроскоп.

6. После окончания процедуры демаскирования промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

7. Обработать культуру раствором первичных антител. Существует два основных способа заливки первичными антителами. Первый способ, когда образец окрашивается в капле раствора антител (рис. 6). Этот способ позволяет производить окраску меньшим количеством антител, но не может гарантировать равномерность окраски. Второй способ – образец полностью погружается в раствор антител. Для этого требуется большее количество антител, однако это гарантирует равномерную окраску всего образца. Предпочтительнее второй вариант окраски.

Рис. 6. Варианты обработки образца растворами антител

Образец инкубируется с раствором первичных антител в течение 2-3 часов при комнатной температуре или 12 часов при температуре (+4-+60С).

8. После окончания инкубации исследуемый образец промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

9. Инкубация с раствором вторичных антител. Исследуемый образец инкубировать с раствором вторичных антител в течение 2-3 часов при комнатной температуре или 12 часов при температуре (+4-+60С).

10. После окончания инкубации образец промыть полифосфатным буфером.

11. На флюорисцентном (конфокальном) микроскопе визуально оценить флюорисценцию Су5 и Alexa 488, локализация красителей соответствует локализации определяемых антигенов.

Контрольные вопросы

1.  Значение иммуногистохимии в исследовательской работе.

2.  Основные стадии проведения иммуногистохимического анализа.

3.  Перечислите специфические маркеры нейронов, астроцитов.

Занятие 3. Подготовка образца (фиксация образца, демаскирование антигена)

3.1. Фиксация

Фиксация – это одна из ключевых стадий иммуноцитохимического исследования. Идеальным фиксатором является тот, который способен:

• максимально сохранить структуру объекта (сохранность взаиморасположения интересующих объектов, сохранность ультраструктуры),

• обеспечить химическую сохранность интересующего нас антигена (сохранность сайтов связывания антел-антигена),

• сохранить объект как можно дольше (сохранность образца месяцы, годы),

• не способность фиксатора влиять на дальнейшие этапы исследования (реактивные группы фиксатора должны быть полностью инактивированы после окончания фиксации),

• обеспечить отсутствие автофлюорисценции или, по крайней мере, не усиливать ее в интересующей нас области спектра (если речь идет об использовании флюорисцентных маркеров).

В настоящее время не существует фиксатора, который полностью бы отвечал всем этим качествам. Исследователь должен четко представлять, что в конкретном случае представляет интерес и чем он готов пожертвовать.

Все фиксаторы можно условно разделить на несколько групп.

«Крослинкеры» – фиксация обеспечивается за счет ковалентного связывания молекул под воздействием фиксатора.

К «крослинкерам» относятся: формалин, параформальдегид (ПФА), глютаровый альдегид (ГА), этилен-гликоль-бис-сукцинимидил сукцинат (ЭГС), акролеин, пикриновая кислота. Все эти соединения обеспечивают хорошую структурную сохранность и долгую сохранность зафиксированного объекта. Однако основными проблемами при использовании этой группы фиксаторов являются большая автофлюорисценция и то, что все они при фиксации создают фронт профиксированной ткани через который затруднен доступ к более глубоким слоям.

Наибольшую сохранность структуры объекта обеспечивает глютаровый альдегид. Однако, он вызывает самую большую автофлюорисценцию. Этот альдегид идеален для иммуноцитохимических окрашиваний в электронной микроскопии. ГА быстро фиксирует белки за счет связывания с аминогруппами, но проникает медленно (гораздо медленнее, чем фармальдегид). При применении ГА в иммуноцитохимических исследованиях с флюорисцентной меткой необходимы химические агенты снижающие автофлюорисценцию (не дают 100% результата), либо использование флюорохромов в длинволновой области спектра.

Параформальдегид наиболее часто используемым фиксатором при работе со срезами. Образует метиленовые мостики между различными реактивными группами. Не фиксирует липиды, что вызывает частичное разрушение мембран (добавляют раствор СаСl2 к рабочему раствору). Проникает быстрее ГА, но фиксирует медленнее. Часто используют смесь ГА и ПФА если позволяет метод визуализации препарата, поскольку прореагировавший ПФА является флюорохромом.

Формалин часто используется при работе со срезами. Образует метиленовые мостики между аминогруппами белков. Обеспечивает долговременную сохранность образца, как и другие альдегиды вызывает сильную автофлюорисценцию. Формалин полностью разрушает часть антигенов, другие маскирует, проявление третьих может снизиться в 2-3 раза.

Акролеин используется как добавочный компонент в смеси альдегидов. Он обеспечивает хорошую сохранность образца и цитоскелета, целостноть мембран. Образование большого количества ковалентных сшивок приводит к затруднению доступа антител и сильной автофлюорисценции.

ЭГС обратимо связывается с аминогруппами, образующиеся связи разрушаются при изменении рН (рН более 8,5). Возможность обратимого связывания и химическая природа, образующихся ковалентных сшивок делают ЭГС хорошим фиксатором для монослойных объектов (клеточных культур). Однако низкая растворимость в воде затрудняет его проникновение в толстые образцы (срезы).

Коагуляторы – фиксация объекта обеспечивается за счет удаления воды из клеток.

К коагуляторам относятся: спитры (метанол, этанол), хлороформ, ацетон.

Коагуляторы обеспечивают хорошую сохранность большинства эпитопов (сайтов связавыния антиген-антитело). Их основное преимущество по сравнению с крослинкерами отсутствие автофлюорисценции. Кроме того, применение коагуляторов (за счет разрушения липидного компонента), обеспечивает хороший доступ антител к ангену. Это делает коагуляторы хорошими фиксаторами для большинства внутриклеточных антигенов в культуральных исследованиях. Коагуляторы плохо сохраняют структуру объекта: мембранные органеллы (митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи) не сохраняются, ядро изменяет свою истинную морфологию. Кроме того из-за эксптракции липидов может изменяться взаиморасположение объектов на клеточной мембране. Разрушаются сайты связывания фаллоидина на актине. Коагуляторы плохо подходят для фиксации срезов и других крупных объектов. Часто этот способ фиксации используют как дополнительный при работе с альдегидами. Коагуляторы действуют очень быстро, и после отмывания фиксатора практически полностью отсутствует остаточное действие, то есть они не влияют на ход последующих стадий анализа.

Температурная фиксация (замораживание и кипячение).

В настоящее время эти способы фиксации, как основные, не используются.

Заморозка – это стабилизация образца на какое-то время, но при размораживании объекта для проведения последующих стадий иммуноцитохимического анализа чаще всего необходима дофиксация. Замораживание приводит к нарушению морфологической структуры, но сохраняет большинство сайтов связывания.

Кипячение или нагрев в микроволновой печи используют как дополнительный метод, требующий тщательного контроля температуры и интенсивности микроволнового воздействия, поскольку больше разрушает, чем стабилизирует образец. Однако достаточно широко используется, как дополнительный метод при работе с парафиновыми срезами.

Кроме фиксации методом погружения образца в фиксатор широко используются перфузионные методы фиксации.

Процедура фиксации должна быть быстрой, чтобы максимально сохранить антигенные компоненты и морфологию ткани и не допустить лизиса клеток, приводящего к потере и диффузии антигенов.

Таблица 1

Некоторые наиболее часто используемые фиксаторы

(для культур клеток и вибратомных срезов)

	Фиксатор	Примечание
1.	Метанол (иногда используется 96% этанол)	Применяется охлажденный (-200 С) метанол. Используется для фиксации культур, реже вибратомных срезов. Время фиксации для культур 5-10 секунд, для срезов 1 минута.
2.	Формалин 4% (PBS+4%формалин + 2% тритонХ100)	Используют нейтральный забуференный формалин, который готовят из 40% формалина. Время фиксации для культур 5 минут, для срезов 30 минут.
3.	Этанол-формальдегид (1–2% раствор формалина на 80° этаноле)	Время фиксации для культур 3 минут, для срезов 15 минут.
4.	Смесь двух альдегидов (РНЕМ+2%,формалин + 0,02%, акролеин + 2%, тритон Х100)	Время фиксации для культур 5 минут, для срезов 30 минут.
5.	Смесь трех альдегидов (РНЕМ+ 2% формалин + 0,02%, акролеин + 0,02%, глютаральдегид + 2%, тритон Х100)	Хорошо подходит для выявления белков цитоскелета. Время фиксации для культур 5 минут, для срезов 30 минут.

PBS – полифосфатный буфер