Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 4 )

PHEM: PIPES+HEPES+EGTA+Mg

После фиксации образец можно хранить. Добавление в раствор для хранения 0,03% азида натрия обеспечивает сохранность препарата до 6 месяцев. Азид натрия не нужно добавлять при работе с реагентами, связывающими пероксидазу, поскольку азид натрия является ее ингибитором.

3.2. Демаскирование антигена

В основе иммунологического окрашивания лежит процесс связывания антигена и антитела. Большинство антигенов не доступны для антител: это относиться не только к внутриклеточным антигенам, но и внеклеточным антигенам, эпитоп которых (участок связывания антиген-антитело) пространственно блокирован от связывания с антителом, окружающими молекулами или конформацией самого антигена. Кроме того, использование парафиновых срезов затрудняет проникновение антител вглубь образца. Демаскирование позволяет открыть эпитопы антигена для связывания с антителом. Демаскирование проводят путем термичекой обработки или обработки образца раствором кислот и щелочей, буферах с кальциевыми хилаторами и органических растворителях.

Температурное демаскирование часто проводят для парафиновых срезов:

• нагревание менее 900С, от одного часа до суток, в зависимости от толщины препарата;

• 1000С - 120 0С (микроволновка), 5минут - 1 час, в зависимости от толщины препарата.

Химическое демаскирование (наиболее часто используемые демаскирующие агенты):

• твин 20, твин 80 - поверхностно активные вещества, которые используются, как эмульгаторы в моющих средствах;

• тритон Х 100 - неионное поверхностно активное вещество. Используется как детергент в биохимических исследованиях. Может быть использован для разрушения мембран эукариотических клеток, для экстракции ДНК. Применение поверхностно активных веществ дает возможность провести быстрое и качественное демаскирование и увеличить проницаемость мембран. Для предотвращения солюбилизации (растворение нерастворимых в данном растворе веществ под влиянием ПАВ) в растворы детергентов добавляют 1-3% белка (например: бычьего сывороточного альбумина). Поверхностно активные детергенты применяют в очень низких концентрациях, увеличение концентрации может привести разрушению эпитопов и даже нарушению морфологической целостности объекта.

Примеры растворов для демаскирования и увеличения проницаемости мембран:

• 10 мМ цитратный буфер, 0,05% Твин 20, рН=6 доводят НСl;

• 10 мМ Трис (гидроксиметил), 1мМ ЭДТА, 0,05% Твин 20, рН= 9;

• полифосфатный буфер, 0,01-0,003% Тритон Х 100.

Лабораторная работа №2 "Влияние различных фиксаторов на морфологическую сохранность образца"

Одна из основных задач иммуноцитохимического окрашивания – изучение взаиморасположения и морфология различных клеточных структур. Большое значение имеет не только наличие или отсутствие определенных субклеточных образований, но и морфология объекта. Это имеет принципиальное значение для белков цитоскелета, митохондрий и многих других органелл. Применение фиксаторов и детергентов может привести к потере морфологии и изменению результата исследования.

Цель работы: провести окраску препарата используя три различных фиксатора.

Оборудование: см. лабораторную работу №1.

Реактивы:

1. Полифосфатный буфер (или раствор Хенкса).

2. Метанол (охлажденный -200С).

3. Формалин 4%: 40%. Формалин разводят полифосфатным буфером в соотношении 1:9.

4. Глютаровый альдегид 2,5%. Глютаровый альдегид 25% разводят фосфатным буфером (рН=7,4) в соотношении 1:9.

5. Детергент: 0,03% раствор тритонХ100 в полифосфатном буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) или 3% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

6. Раствор первичных антител. Куриные антитела к GFAP разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1:400. Мышиные антитела к NeuN разводят в соотношении 1:150. В раствор антител вносят 1% БСА или 3% ЭТС.

7. Раствор вторичных антител. Антитела против константных доменов куриных антител, меченные флюорисцентным красителем Cy5, которые разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1:200. Антитела против константных доменов мышиных антител, меченные флюорисцентным красителем Alexa 488 разводят в полифосфатном буфере в соотношении 1;200. В раствор антител вносят 1% БСА или 3% ЭТС.

Ход работы:

1. Полностью убрать культуральную среду.

2. Диссоциированную культуры промыть 2 раза по 5 минут полифосфатным буфером.

3. Зафиксировать одну из культур ледяным метанолом на льду. Время фиксации 10 секунд. Вторую культуру зафиксировать 4% формалином на 5-10 минут. Третью зафиксировать 2,5% глютаровым альдегидом. Время фиксации 2 часа. После фиксации фиксатор убрать.

4. Промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

5. Добавить раствор детергента для проведения демаскирования антигенных детерминант (30 минут). При проведении демаскирования необходимо контролировать морфологическую целостность культуры в световой микроскоп.

6. После окончания процедуры демаскирования промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

7. Обработать культуру раствором первичных антител.

Образец инкубируется с раствором первичных антител в течение 2-3 часов при комнатной температуре или 12 часов при температуре (+4-+60С).

8. После окончания инкубации исследуемый образец промыть полифосфатным буфером 3 раза по 5 минут.

9. Инкубация с раствором вторичных антител. Исследуемый образец инкубировать с раствором вторичных антител в течение 2-3 часов при комнатной температуре или 12 часов при температуре (+4-+60С).

10. После окончания инкубации образец промыть полифосфатным буфером.

11. На флюорисцентном (конфокальном) микроскопе визуально оценить флюорисценцию Су5 и Alexa 488, локализация красителей соответствует локализации определяемых антигенов. Необходимо оценить морфологию астроцитов в культурах, фиксированных различными способами. Идентичны ли полученные результаты? Какой из фиксаторов наилучшим образом обеспечил морфологическую целостность и сохранность глиальных клеток? Какой способ фиксации позволил не только сохранить морфологию астроцитов, но и полностью проявиться окраске ядерного белка NeuN.

Контрольные вопросы

1. Что такое фиксация образца? Зачем она нужна?

2. На какие основные группы условно разделяют используемые в настоящее время фиксаторы?

3. В чем преимущества и недостатки использования альдегидов для фиксации препарата?

4. Может ли фиксатор улучшить проникновение антител к месту локализации антигена?

5. Зачем необходима процедура демаскирования антигена?

Занятие 4. Визуализация полученных результатов

Для визуализации места связывания антигена с антителом используется целый ряд меток:

• флюорохромы;

• ферменты;

• металлы и металлопротеиды;

• радиоизотопы;

• промежуточные связующие вещества, например, биотин, дигоксин.

Данные метки могут быть присоединены как к первичным антителам (прямой метод), так и к вторичным (непрямой метод).

4.1. Флюорохромы

Флюорохром – фрагмент молекулы, придающий ей флуоресцентные свойства. Для визуализации антигена с помощью антител, конъюгированных с флюорохромом необходим флюорисцентный микроскоп. Флюорохромы способны поглощать квант света одной длинны волны и испускать в более длинноволновой области. Первые флюорхромы, такие как FITС – флюоресцеина изотиоционатом, TRITC – тетраметилродамин изотиоционатом – достаточно быстро разрушаются, что приводит к «выгоранию препарата», то есть потере флюорохрома флюорисцентных свойст. Это была одна из причин, почему метод флюорисцентной иммуноцитохимической окраски не получил широкого распространения во второй половине двадцатого века. Современные флюохромы более устойчивы стабильны, кроме того в настоящее время широко используются реагенты, которые препятствуют "выгоранию" флюорохрома.

4.2. Ферментные метки

Самый распространенный метод иммунного окрашивания. Одна молекула фермента, конъюгированная с антителом, способна «обработать» большое количество молекул субстрата, образовавшийся нерастворимый краситель накапливается в ткани вокруг фиксированного к антигену антитела. Чаще всего в качестве ферментной метки используются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и глюкозоксидаза.

Пероксидаза хрена выделена из корня хрена, она расщепляет перекись водорода. Метод выявления активности пероксидазы основан на окрашивании хромогена, который выступает в роли донора электронов, в присутствии перекиси водорода. Эндогенная пероксидаза содержится в большом количестве в иммунокомпетентных клетках, поэтому антитела меченые перексидазой не используют для окраски мазков крови и препаратов костного мозга. При работе с другими тканями эндогенную пероксидазу блокируют добавлением перекиси водорода до обработки препарата первичными антителами.