Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 9 )

Необходимые реактивы:

1. Фосфатный буфер (PBS)-137 mM NaCl, 2.7 mM Kl, 8.1 mM Na2HPO4 , pH7.2 – 7.4, фильтровать 0,2 µm фильтром.

2. Промывочный буфер (Wash Buffer) 0.05 % раствор Tween 20 в PBS pH7.2 – 7.4, фильтровать 0,2 µm фильтром.

3. Растворитель для реагентов (Reagent Diluent) – 1% BSA (альбумин бычий сывороточный) в PBS pH7.2 – 7.4, фильтровать 0,2 µm фильтром.

4. Субстратный раствор – 1:1 H2O2 и Tetrametilbenzidine (смешивать за 15 мин перед внесением).

5. Стоп – реагент – 2 N H2SO4 .

Подготовка пробы.

Для исследования в лабораторию доставляют негемолизную сыворотку. Возможно использовать замороженную сыворотку при –20º С, хранящуюся не более 6 месяцев.

Разведение калибровочных растворов.

Развести standart (рекомбинантный белок BDNF) в 2 мл деонизированной H2O – получаем рабочую концентрацию 4000 pg/ml. В полипропиленовые пробирки 1,5 мл добавляем по 300 мкл Reagent Diluent. Далее делаем 6 последовательных разведений, тщательно перемешиваем (не допускать образование пузырей) по схеме:

Ход работы:

1. Поместить в рамку необходимое количество стрипов – исследуемые образцы в 2 повторах и 12 лунок для калибровочных проб и контрольной сыворотки.

2. Внесите в каждую лунку по 100 мкл Reagent Diluent.

3. Внесите в соответствующие лунки в дубликатах по 50 мкл каждой калибровочной пробы и контрольной сыворотки. Одну лунку оставить пустую – Blanк. Внесение калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов необходимо произвести в течение 5–10 минут.

4. Заклеить липкой пленкой, инкубировать 2 часа при комнатной температуре.

5. Добавить в каждую лунку по 100 мкл HRP-conjugate (кроме лунки бланк).

6. Заклеить планшет и инкубировать 60 мин при при комнатной температуре.

7. По окончании инкубации снять липкую пленку и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промыть лунки планшета 5 раз промывочным раствором (Wash Buffer). В каждую лунку вносить не менее 250 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки. Необходимо добиться полного опорожнения лунок после каждого их заполнения. По окончании промывки остатки влаги тщательно удалить, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

8. Внесите во все лунки по 200 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2–3 мин. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре (+18...+25 °С) в течение 30 минут в зависимости от степени развития синего окрашивания.

9. Внесите во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 50 мл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.

10. Измерить величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Измерение ОП содержимого лунок планшета необходимо произвести в течение 15 мин после внесения стоп-реагента.

11. Строим график зависимости оптической плотности от концентрации BDNF в калибровочном растворе. По калибровочному графику определяем концентрацию BDNF в образцах.

Обсуждаем полученные результаты, делаем вывод о содержании BDNF в сыворотке крови.

Занятие 8. Системы усиления сигнала. Авидин-биотиновый комплекс

Применение авидин-биотинового комплекса позволяет значительно повысить чувствительность ИФА, так как при синтезе конъюгата с одной молекулой АТ можно связать десятки молекул биотина. Получение конъюгатов (антител и ферментов с биотином) осуществляется достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической и ферментативной активности. Конъюгаты ферментов с биотином могут быть использованы как универсальные реагенты. Белок авидин может неспецифически сорбироваться на других молекулах, поэтому все чаще используют другой биотинсвязывающий белок – стрептавидин, обнаруженный в бактериях Streptomyces avidinii. Стрептавидин также образует прочный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц.

Лабораторная работа №6 «Определение концентрации GDNF в сыворотке крови»

Цилиарный (глиальный) нейротрофический фактор (GDNF), представляет собой полипептид GDNF – фактор дифференцировки развития нейронов и глиальных клеток, образующийся в клетках-мишенях. Предполагают, что при внутриклеточном хранении фактор GDNF является молекулой, ассоциированной с повреждением, обеспечивая поврежденным нейронам трофическую поддержку или выживание после травмы. Человеческий GDNF представляет собой одноцепочечный полипептид из 200 аминокислотных остатков с м. м. 22,7 кДа.

Цель работы – освоить иммуноанализ сэндвич-типа с усилением сигнала. Определить концентрацию глиального нейротрофического фактора в сыворотке крови.

Оборудование:

Шейкер BioSan Thermo-Shaker TS-100, вортекс BioSan, микропланшетный спектрофотометр BioTek Еpoch, термостат, пипетка автоматическая Transferpette 1-10 мкл, пипетка автоматическая Transferpette 10-100 мкл микро, пипетка автоматическая Transferpette 100-1000 мкл, Пипетка автоматическая многоканальная Transferpette 100-300 мкл.

Расходные материалы:

Нестерильные наконечники для дозатора (Biohit), 1-10 мкл нестерильные наконечники для дозатора (Biohit), 300 мкл нестерильные наконечники для дозатора (Biohit), 1000 мкл, штатив для пробирок на 96 мест ИФА, ванночки пластиковые одноразовые для ИФА, клейкие пластинки на планшет для инкубации Adhesive Strip (For 96 wells), полистироловые EIA стрипы Costar EIA Plate высокой сорбции, полипропиленовые пробирки 1,5 мл, 5 мл.

Необходимые реактивы:

1. Фосфатный буфер (PBS) - 137 mM NaCl, 2.7 mM Kl, 8.1 mM Na2HPO4 , pH7.2 – 7.4, фильтровать 0,2 µm фильтром.

2. Промывочный буфер (Wash Buffer) 0.05 % раствор Tween 20 в PBS pH7.2 – 7.4, фильтровать 0,2 µm фильтром.

3. Растворитель для реагентов (Reagent Diluent) – 1% BSA (альбумин бычий сывороточный) в PBS pH7.2 – 7.4, фильтровать 0,2 µm фильтром.

4. Антитела для сорбции (Capture Antibody) - готовим рабочий раствор с концентрацией мышиных антител против человеческого GDNF в PBS 2,0 µg/ml (Part 840189, R&D).

5. Вторичные антитела (Detection Antibody) биотинилированные козьи против GDNF человека рабочая концентрация 100ng/ml (Part 840190, R&D).

6. Стандарт GDNF(лиофилизированный белок) (Part 840191, R&D).

7. Стрептавидин конъюгированный пероксидазой хрена (Streptаvidin- HRP) Готовим рабочее разведение конъюгата непосредственно перед внесением в плашку(Part 890830, R&D).

8. Субстратный раствор – 1:1 H2O2 и Tetrametilbenzidine (смешивать за 15 мин перед внесением) (R&D Systems Catalog,№ DY999).

9. Стоп – реагент – 2 N H2SO4 .

Подготовка пробы.

Для исследования в лабораторию доставляют негемолизную сыворотку. Возможно использовать замороженную сыворотку при – 20ºС, хранящуюся не более 6 месяцев.

Разведение калибровочных растворов.

Восстановить рекомбинантный белок GDNF (standart) в 0.5 мл Reagent Diluent – получаем максимальную калибровочную концентрацию 2000 pg/ml. В полипропиленовые пробирки 1,5 мл добавляем по 300 мкл Reagent Diluent. Далее делаем 6 последовательных разведений, тщательно перемешиваем (не допускать образование пузырей) по схеме:

Ход работы:

1. Поместить в рамку необходимое количество стрипов – исследуемые образцы в 2 повторах и 12 лунок для калибровочных проб и контрольной сыворотки.

2. Сорбция антитела на плашку: Раскапываем на плашку по 100 мкл раствора антигена. Заклеиваем планшет липкой лентой, чтобы предотвратить высыхание.

3. По окончании инкубации снять липкую пленку и поместить ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промыть лунки планшета 5 раз промывочным раствором (Wash Buffer). В каждую лунку вносить не менее 200 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки. Необходимо добиться полного опорожнения лунок после каждого их заполнения. По окончании промывки остатки влаги тщательно удалить, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

4. Неспецифическое связывание исключаем добавлением в каждую лунку по 100 мкл Reagent Diluent. Инкубация 1-2 часа. Заклеиваем планшет новой липкой лентой, чтобы предотвратить высыхание.

5. Промывка (см. пункт 3).

6. Специфическое связывание антигена (сыворотка крови) с антителом сорбированным на пластик. Внесите в соответствующие лунки в дубликатах по 100 мкл каждой калибровочной пробы и контрольной сыворотки. Одну лунку оставить пустую – Blanк. Внесение калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых образцов необходимо произвести в течение 5–10 минут.

7. Заклеить липкой пленкой, инкубировать 2 часа при комнатной температуре.

8. Промывка (см. пункт 3).

9. Внесите в соответствующие лунки по 100 мкл Detection Antibody в рабочем разведении. Заклеиваем планшет новой липкой лентой. Инкубация 2 часа при комнатной температуре.

10. Промывка (см. пункт 3).

11. Добавить в каждую лунку по 100 мкл Streptаvidin- HRP - conjugate (кроме лунки бланк).

12. Заклеить планшет и инкубировать 20 мин при комнатной температуре.

13. Промывка (см. пункт 3).

14. Внесите во все лунки по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2–3 мин. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре (+18...+25 °С) в течение 20 минут в зависимости от степени развития синего окрашивания.

15. Внесите во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 50 мл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.