Иммунохимические методы исследований клеточных культур и тканей (стр. 2 )

• низкая чувствительность метода – моноклональные антитела связываются только с одним участком молекулы антигена, и это обусловливает слабое иммунное окрашивание;

• высокая вероятность ложноотрицательного результата – если при фиксировании биологического субстрата произойдет разрушение единственного эпитопа, то иммунное окрашивание не произойдет.

В настоящее время для иммунохимических исследований широко используются моноклональные и поликлональные антитела.

Антитела можно соединить с флюорохромами или ферментами, полученные антитела называются мечеными или конъюгированными, такие антитела используются для визуализации реакции АТ-АГ.

Добавление к биологическому субстрату меченных флуоресцентной или ферментативной меткой АТ, позволит нам определить место связывания и количество связанных антител, что соответствует локализации и количеству антигена в исследуемом образце (рис. 2).

Рис. 2. Схема прямого иммунохимического окрашивания

Такой метод окрашивания получил название ПРЯМОЕ ОКРАШИВАНИЕ, то есть окрашивание, при котором меченные первичные антитела непосредственно связываются с антигеном. Это наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая, так как на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело.

В последнее время прямое окрашивание используется крайне редко, это связанно с тем, что при прямом окрашивании уровень флюорисцентного или ферментативного сигнала может быть низким, что затрудняет исследования. В последнее время чаще используют НЕПРЯМОЕ ОКРАШИВАНИЕ, с усилением сигнала. При непрямом окрашивании первичное антитело не связанно с меткой, для визуализации используются вторичные антитела, которые могут быть конъюгированы с большим числом молекул флюорохрома (рис. 3).

Рис. 3. Схема непрямого иммунохимического окрашивания

Первичные антитела реагируют с антигенами ткани. Связанные с меткой вторичные антитела специфически взаимодействуют с Fc-фрагментом первичных антител, которые для вторичных антител будут являться антигенами. Метод непрямого окрашивания значительно чувствительнее прямого, поскольку с каждой молекулой первичных антител связывается несколько молекул вторичных антител, содержащих метку.

Непрямое окрашивание имеет ряд преимуществ:

• первичные антитела свободны от метки и легче проникают к антигенам;

• с одним первичным антителом может связаться несколько молекул вторичных антител, это приводит к усилению сигнала;

• большое количество вторичных антител к Fc- фрагменту получать легче и легче произвести конъюгирование антител с меткой.

Однако непрямой метод окрашивания включает в себя дополнительную стадию в процедуре анализа, кроме того использование вторичных антител увеличивает вероятность неспецифических перекрестных реакций. 

 В настоящее время для усиления сигнала, в качестве вторичных антител могут быть использованы не полные антитела, а Fab-фрагменты, конъюгированные с флюорисцентной меткой меткой. Размер Fab-фрагментов много меньше полных антител. Fab-фрагменты легче проникают к месту связывания. Использование подобной технологии позволяет многократно усилить количество молекул флюорохрома на одну молекулу антигена (рис. 4).

Рис. 5. Cхема непрямого иммуноцитохимического исследования с использованием конъюгированных Fab-фрагментов вторичных антител

Таким образом, знание механизмов функционирования иммунной системы, аналитических иммунохимических подходов и методов является основой для изучения структурных и функциональных характеристик биологических молекул. Специфичность иммунной реакции позволяет повысить достоверность идентификации и точность количественного определения по сравнению с аналитическими методами, основанными на использовании красителей или других химических реагентов.

Контрольные вопросы

1.  Из каких функциональных областей состоит молекула иммуноглобулина G?

2.  Что такое "эпитоп"?

3.  Какая область антитела отвечает за связывание антигена?

4.  Что такое моноклональные антитела? Назовите преимущества использования моноклональных антител?

5.  Чем различаются прямое и непрямое иммуноцитохимическое окрашивание? Какие достоинства и недостатки имеет метод прямого окрашивания?

6.  Почему при непрямом двойном иммуноцитохимическом окрашивании первичные и вторичные антитела должны быть получены от разных животных?

Занятие 2. Иммуногистохимия.

Основные этапы проведения иммуногистохимических исследований

Впервые идея определения локализации молекул в тканях с помощью специфических флюорисцентных красителей, связанных с антителами была реализована в 40-е годы двадцатого века. Альберт Кунс использовал флюорисцентные соединения изоцианата для обнаружения пневмококка в печени мыши в 1941 году. В 1958 году Ригс в своей работе использовал флюорисцентный изотиоцианат (FITC), связанный с антителами. Эти работы стали первыми в мире работами по иммунологическому окрашиванию. Однако метод не получил широкого распространения из-за большой сложности получения антител, сложности визуализации и низкой воспроизводимости результатов.

Впоследствии иммуноцитохимические методы стали применяться в молекулярной биологии, а с середины 70-х годов, после открытия моноклональных антител, их роль еще более возросла. В 1993 году появились новые флюорисцентные красители, которые многократно увеличили возможности метода. С этого момента иммуноцитохимическое окрашивание стало использоваться повсеместно, как в клинической диагностике, так и в исследовательской работе.

Иммуноцитохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые компоненты (антигены), основываясь на их связывании с антителами. Место связывания определяют при помощи меченых антител. Использование такого подхода позволяет детально исследовать функции и химический состав клеток и сопоставлять полученные результаты с известными морфологическими данными, что дает возможность более детального изучения молекулярных механизмов.

Для разных объектов количество и продолжительность стадий иммуноцитохимического исследования может сильно различаться, однако для всех объектов можно выделить основные стадии проведения анализа:

• фиксация;

• обработка образца или приготовление срезов;

• демаскирование антигена для лучшего связывания первичного антитела с антигеном;

• увеличение проницаемости;

• блокирование неспецифического связывания;

• обработка первичными антителами;

• обработка вторичными антителами конъюгированными с флюорохромом или любым другим окрашенным агентом;

• заключение препарата;

• оценка полученных результатов.

Количество и порядок стадий могут меняться в зависимости от объекта исследования или специфики оборудования, на котором проводят исследования. Часто фиксация следует за приготовлением прижизненных срезов или обработки культур клеток. Это необходимо если иммуноцитохимические исследования являются терминальной стадией большого комплексного исследования того или иного образца.

В настоящее время используется большое количество первичных антител меченых флюорисцентной меткой, при этом отпадает необходимость применения вторичных антител в процедуре анализа. Однако, необходимо помнить, что применение вторичных антител необходимо для усиления сигнала. То есть на один антиген может приходиться не одна молекула флюорохрома, а гораздо больше, в то время как применение первичных антител меченных флюорохромом не может усилить сигнал. Прямое окрашивание, обычно применяют для антигенов с сильной экспрессией, например белков цитоскелета и практически не применяют для антигенов со слабой экспрессией, например рецепторов.

Использование прямого объектива с водной иммерсией для оценки результатов иммуноцитохимического исследования приводит к тому, что из процедуры анализа полностью исключается стадия заключения образца, поскольку заключающей средой в данном случае служит вода или солевой раствор, используемый для промывки образцов.

Лабораторная работа №1 "Иммуноцитохимическое маркирование нейронов и астроцитов в культуре клеток"

Важным функциональным показателем нервной системы является наличие и соотношение зрелых нейронов и астроцитов. В процессе дифференцировки нервной ткани нейроны и глия проходят несколько последовательных стадий развития. Каждая из этих стадий сопровождается экспрессией определенных маркеров. Для зрелых нейронов выделено несколько специфических маркеров - белки цитоскелета, белки связанные с синаптическими мембранами, ядерные белки. Одним из наиболее часто используемых, является специфический ядерный маркер NeuN. NeuN характерен только для зрелых нейронов всех типов, этот белок не экспрессируется на более ранних стадиях развития. Для маркирования астроцитов традиционно используются антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP).

Цель работы: провести иммуноцитохимическое окрашивание ядерного белка NeuN (маркера зрелых нейронов) и GFAP (маркера астроцитов).