Экспериментально-морфологический анализ влияния уменьшения численности пометов и воспитания в искусственно сформированных пометах на показатели развития головного мозга, надпочечников и гонад у крыс (стр. 2 )

Апробация диссертации

Материалы исследования представлены XII краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов (январь 2010 г, г. Хабаровск), на заседании Хабаровского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (март 2010 г, г. Хабаровск), на 11-ой Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (апрель 2010 г, г. Владивосток).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 5 в журналах, входящих в Перечень ведущих научных журналов и изданий ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста, включая 29 таблиц, 60 рисунков. Список литературы содержит 351 источник, в том числе 178 иностранных и 173 отечественных. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав собственных данных, заключения, выводов и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе были исследованы 181 беспородная белая крыса из 22 пометов, полученных от спаривания интактных 4,5 – 5,5 месячных самок и самцов.

В первом разделе работы изучалось влияние уменьшенной численности пометов на показатели развития мозга, гонад и надпочечников крыс.

В 1-ой группе исследованы 14-дневные крысы из пометов с экспериментально уменьшенной численностью (2 помета, 11 крысят). Контролем к ним являлись 14-дневные животные из пометов средней численности (2 помета, 20 крысят). Во 2-ой группе исследовались 30-дневные животные, воспитанные в пометах уменьшенной численности (3 помета, 18 крысят). Контролем для них служили 30-дневные крысы из пометов средней величины (3 помета, 31 крысенок). 3-ю группу составили 40-дневные животные из пометов с уменьшенной численностью (6 пометов, 30 крысят). Контролем для них были 40-дневные крысы из пометов средней численности (2 помета, 24 крысенка). Уменьшение численности пометов достигалась путем удаления из пометов средней величины (число крысят – 9-10) по 4-5 крысят в однодневном возрасте.

Во втором разделе работы исследовались особенности развития мозга, надпочечников и гонад 40-дневных крыс, воспитанных в искусственно сформированных, «смешанных» пометах (4 помета, 47 крысят). Они были образованы из пометов средней величины (число крысят - 8-10), в которые были добавлены по 4-6 «приемных» крысенка и убрано по столько же «родных». Контролем для них служили 40-дневные крысята из «естественных» пометов средней численности (2 помета, 24 крысенка).

Все животные сравниваемых групп содержались одновременно в условиях одного вивария, корм и воду получали ad libitum. Для изучения ВНД животные в 30-дневном возрасте были подвергнуты исследованию в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). Забой контрольных и подопытных животных проводили одновременно, декапитацией. Взвешиванием на электронных весах определяли массу тела, мозга, полушария, гонад и надпочечников. Левое полушарие фиксировали в течение 1 часа в жидкости Карнуа. Затем его разрезали в переднетеменной (ПТД) и собственно теменной долях (СТД) строго перпендикулярно длиннику и верхней поверхности левого полушария, пользуясь схемами (1962), заливали в парафин. На микротоме фирмы Reichert готовили срезы, толщиной 7 мкм. Их окрашивали метиленовым синим, а также - галлоцианином на нуклеиновые кислоты (НК) по Эйнарсону (З. Лойда и соавт., 1982).

Проводилось обзорное изучение препаратов ПТД и СТД, их морфометрическое исследование, которое включало в себя:

1. Определение толщины коры головного мозга. Проводилось измерение в 3 участках ПТД и СТД при помощи окуляр-микрометра МОВ – 15, при увеличении объектива х8 (, 1990). Аналогично проводилось измерение толщины слоя I коры головного мозга.

2. Определение плотности расположения нейронов производили при увеличении окуляра х10, объектива на х40 в слоях II и V ПТД и СТД, в 5 стандартных (S=10000 мкм2) полях зрения каждого слоя.

3. Измерение площади сечения цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоев II и V ПТД и СТД и поля САI гиппокампа осуществляли с помощью компьютерной морфометрии на аппарате «Мекос» (медицинские компьютерные системы). В каждой из этих зон измеряли по 25 клеток.

Гистохимические исследования включали:

1. Определение концентрации НК в цитоплазме, ядрах и ядрышках пирамидных нейронов слоя II и V ПТД и СТД, поля САI гиппокампа на препаратах, окрашенных галлоцианином по Эйнарсону, на аппарате «Мекос» по оптической плотности этих структур при λ=550 нм. В мозге каждого животного исследовали по 25 клеток каждой из указанных областей.

2. Определение активности NADH-d и NADPH-d проводили тетразолиевым методом по Loida (З. Лойда и соавт., 1982) в нейронах слоев II, V СТД и поля САI гиппокампа. Из СТД правого полушария готовили криостатные срезы толщиной 20 мкм, которые монтировались на покровные стекла. Инкубацию проводили в термостате при температуре 370С в течение 30 минут. Результат оценивали измерением оптической плотности продуктов реакции в цитоплазме на аппарате «Мекос» (λ=550 нм). Исследовали 25 нейронов каждой из указанных областей.

Из левых надпочечников, яичников и семенников готовили криостатные срезы толщиной 20 мкм, проходящие через центральную часть органа. Они монтировались на покровные стекла и на них проводили реакции на 3β-гидроксистероиддегидрогеназу (ГСДГ). Активность ГСДГ исследовалась по методу З. Лойда (1982). Интенсивность реакции оценивалась цитофотометрически с использованием аппарата «Мекос» при λ=550 нм. В каждом случае проводили измерения в 25 адренокортикоцитах каждой из зон коры надпочечника, в 25 клетках внутренней теки полостных фолликулов и клетках Лейдига семенника. На этих же препаратах окуляр-микрометром МОВ-15 измеряли толщину коркового вещества надпочечника, диаметр наибольшего полостного фолликула и средний диаметр семенного канальца.

Показатели ВНД оценивались по параметрам регистрации поведенческих актов у 30-дневных крысят в ПКЛ. Во время опыта каждое животное помещалось в лабиринт, где в течение 3 минут регистрировали суммарное время и количество элементарных поведенческих актов: свешиваний, стоек, груминга, принюхиваний, движений, заходов в открытые и закрытые рукава. По перечисленным компонентам поведения определялись интегральные характеристики: исследовательская активность и уровень тревожности ( и соавт., 2002). Во время забоя животных осуществляли забор крови. В сыворотке определяли концентрации тестостерона и эстрадиола стандартными иммуноферментными методиками. Эти исследования проведены под руководством д. б.н., проф. .

Статистический анализ проведен с помощью пакета прикладных программ Statistiсa 6.0. Высчитывались среднее арифметическое значение (М), ошибка (±m), медиана. Различия считались достоверными при Р<0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В первой части работы нами были изучены особенности некоторых показателей развития головного мозга, надпочечников и гонад 14-, 30- и 40-дневных крыс из пометов с экспериментально уменьшенной численностью.

Подопытные крысы всех возрастных групп имели большую, чем в контроле, массу тела, головного мозга и полушария. Различия массы тела и мозга между подопытной группой и контрольной были наибольшими в 14- и 30-дневном возрасте, наименьшие – в 40-дневном.

Морфометрическое изучение головного мозга выявило у 14- и 30-дневных крыс несколько большую, чем в контроле, толщину коры ПТД (Р>0,05), у 30-дневных – достоверное увеличение толщины коры СТД (1291±19 мкм против 1213±18 мкм в группе контроля). В противоположность этому, у подопытных 40-дневных крысят толщина СТД была меньше таковой у контрольных животных (1279±17 мкм против 1367±15 мкм, Р<0,05). В то же время, толщина коры ПТД у крыс сравниваемых групп не имела статистически значимых различий. Плотность расположения нейронов у подопытных крыс была снижена в 14- и 30-дневном возрасте в слое II СТД, у 30- и 40-дневных – в слое II ПТД (табл. 1, Р<0,05). У 14-дневных подопытных крысят отмечалось достоверное увеличение размеров ядер и ядрышек нейронов слоя II СТД, цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов гиппокампа. Подопытные 30-дневные крысята отличались от контрольных животных увеличенными размерами цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоя II ПТД и СТД, слоя V ПТД, гиппокампа, у нейронов слоя V СТД были увеличены лишь размеры ядрышек (Р<0,05). Характер отклонений от контроля менялся у 40-дневных крыс. Экспериментальные крысята в этом возрасте отличались меньшими размерами цитоплазмы, ядер и ядрышек нейронов слоя II и V ПТД, слоя II СТД, меньшими размерами ядрышек и цитоплазмы нейронов слоя V, ядрышек нейронов гиппокампа.

Концентрация РНК в цитоплазме нейронов слоев II и V ПТД подопытных 14-дневных крысят была ниже, чем в контроле. В 30-дневном возрасте межгрупповых различий по этим показателям не выявлено. В противоположность этому, у 40-дневных крыс концентрация РНК в цитоплазме нейронов слоев II и V ПТД и СТД, гиппокампе мозга подопытных крыс была более высокой, чем в контроле.

Изучение активности NADH - и NADРH-d показало, что у подопытных 14-дневных крысят активность этих ферментов в цитоплазме нейронов слоев II, V СТД и гиппокампа была больше, чем в контроле. Подопытные 30-дневные крысы обладали большей активностью NADH-d во всех изученных нами локализациях, тогда как активность NADРH-d – увеличена в цитоплазме нейронов слоя II и V по сравнению с группой контроля. В противоположность этому, у 40-дневных крыс активность NADH-d в цитоплазме нейронов слоя II СТД, активность NADРH-d – слоя II СТД и гиппокампа были существенно ниже, чем в контроле (табл. 1, Р<0,05).

Таким образом, нами впервые установлено, что экспериментальное уменьшение численности пометов отразилось как на «макропоказателях» развития головного мозга (величина массы мозга и полушария), так и на «микропоказателях», отражающих характер постнатального развития нейронов неокортекса и гиппокампа; при этом были выявлены морфометрические особенности мозга с экспериментально увеличенной массой. По нашему мнению, заслуживает особого внимания тот факт, что отличия мозга подопытных животных от контроля в разные периоды онтогенеза имеют разную выраженность и направленность.