Комплексное фармакокинетическое и фармакодинамическое исследование новых препаратов амлодипина у здоровых добровольцев и больных артериальной гипертензией (стр. 3 )

Через 14 дней после отмены первого изучаемого препарата проводился второй аналогичный курс терапии с другим изучаемым препаратом. Визиты в клинику и процедуры осуществлялись по той же схеме (визиты V3 – V4). 

  Измерение гемодинамических параметров

Параметры гемодинамики измеряли в покое на двух руках в положении сидя трехкратно с интервалом между измерениями в 2-3 мин  непосредственно перед забором очередной пробы крови в соответствии  с утвержденным протоколом. Пациентам в течение 15 мин перед измерением запрещались любые ФН, в т. ч. ходьба по коридорам и лестницам. Выбиралось среднее измеренное значение САД и ДАД. АД определяли с помощью прибора для измерения давления производства MediTech (США). ЧСС регистрировали в течение 1 мин, контролируя время по секундомеру.

Аналитические методы определения амлодипина

Определение концентраций амлодипина выполнялось на базе НПЦ «Пробиотек» (Генеральный директор – к. х.н. ).

Для определения концентрации неизмененного амлодипина в плазме крови добровольцев и пациентов использовали метод ВЭЖХ  с масс-спектрометрическим детектированием.

Препараты и реактивы. В работе была использована субстанция амлодипина безилата (с аналитическим паспортом) производства компании «Maprimed» (Аргентина). Матричные растворы с концентрацией 1 мг/мл  были приготовлены с использованием метанола, из этих растворов готовили растворы стандартных образцов.

Для экстракции и элюентов применяли ацетонитрил, муравьиную кислоту, ацетат натрия, уксусный ангидрид, пиридин, метанол – все реактивы производства “Merck” (ФРГ). Вода – двухступенчатая очистка обратным осмосом и деионизированная (Millipore, Франция).

Для концентрирования и очистки образцов использовали твердофазную экстракцию. Картридж для твердофазной экстракции AccuBond ODS-C18 55 µm, (100 мг, США) предварительно промывали 1 мл  ацетонитрила, 1 мл воды, 2 мл 3% водного раствора муравьиной кислоты. К 1 мл сыворотки добавляли 0,5 мл 9% водного раствора муравьиной кислоты, перемешивали на Vortex’e, центрифугировали 5 мин при  13000 об/мин и супернатант переносили в картридж. Картридж промывали 0,5 мл 3% водного раствора муравьиной кислоты и 1 мл раствора ацетонитрил : вода : муравьиная кислота (15:85:2), затем элюировали определяемое соединение 1 мл раствора ацетонитрил : 0,1 М ацетат аммония : муравьиная кислота (95:5:2). Полученный элюат упаривали досуха под вакуумом при 600С. Сухой остаток растворяли в 100 мкл раствора метанол-вода (50:50) и аликвоту полученного раствора вводили в хроматограф. Степень извлечения амлодипина составила 70,8 ± 2,6 %.

Хроматографический анализ выполняли на жидкостном хроматографе «Agilent 1100» (США) с масс - спектрометрическим детектором (электроспрей). Колонка Eclipce XDB-C8, 5 мкм, 4.6*150 мм (США). Температура разделения 400С. Скорость потока  0,7 мл/мин. Объем пробы 50 мкл. Детектирование проводилось по протонированному молекулярному иону (М+Н)+ с m/z 409,3. Фрагментор 50В, напряжение капилляра 3500В, температура  азота 3500С, скорость газа 9,7 л/мин, давление небулайзера 35 psig.

Для количественного определения использовали метод абсолютной калибровки с применением программного обеспечения фирмы «Agilent». Предел обнаружения амлодипина в плазме крови человека составил 0,20 нг/мл.

Расчет фармакокинетических параметров и статистическая обработка результатов.

Параметры фармакокинетики рассчитывали с помощью программы “M-IND” модельно-независимым методом.

Для статистической обработки результатов использовали программы STATISTICA’6.0 и EXCELXP. Рассчитывали среднее арифметическое (mean), стандартное отклонение (SD), стандартную ошибку (SE), коэффициент вариации (C. V.). Вычисляли коэффициент линейной корреляции между концентрациями активных веществ и параметрами гемодинамики. С помощью дисперсионного анализа  (ANOVA, параметрический метод) определяли достоверность отличий изучаемых фармакокинетических и фармакодинамических параметров и  влияние на них различных факторов.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследования биоэквивалентности

Средние фармакокинетические профили амлодипина у здоровых добровольцев после однократного приема per os 10 мг изучаемых препаратов и Норваска® достоверно не отличались. Однако необходимо отметить, что в 4-м исследовании наблюдалась заметная разница в скорости нарастания концентрации на начальном участке кривой между Амлорусом и Норваском® (рисунки 3 - 6).

Рис. 3 Средние фармакокинетические профили амлодипина у здоровых добровольцев после  однократного приема внутрь 10 мг Амлодипина-1  и Норваска® (n = 18)

Рис. 4 Средние фармакокинетические профили амлодипина у здоровых добровольцев после однократного приема внутрь 10 мг Амлодипина-2  и Норваска® (n = 18).

Рис. 5 Средние фармакокинетические профили амлодипина у здоровых добровольцев после однократного приема внутрь 10 мг Амлодипина-3  и Норваска® (n = 18).

Рис. 6 Средние фармакокинетические профили амлодипина у здоровых добровольцев после однократного приема внутрь 10 мг Амлоруса  и Норваска® (n = 18).

Во всех исследованиях средние значения концентраций амлодипина достоверно не отличались ни в одной временной точке.

Средние значения основных фармакокинетических параметров исследуемых препаратов в сравнении с Норваском представлены в таблице 1.

Таблица 1

Фармакокинетические параметры амлодипина при приеме изучаемых препаратов  в сравнении с Норваском (Mean ± SD).

Препарат	AUC 0-t  (нг*час/мл)	Cmax  (нг/мл)	Tmax  (ч)	T 1/2  (ч)	Cmax/ AUC 0-∞  (ч-1)
Исследование I (n=18)
Амлодипин-1	212,5 ± 108,8	5,77 ± 2,31	4,89 ± 1,71	45,8 ± 21,2	0,031 ± 0,012
Норваск®	207,5 ± 104,2	5,73 ± 2,71	5,00 ± 1,97	44,5 ± 21,8	0,031 ± 0,013
Исследование II (n=18)
Амлодипин-2	168,4 ± 33,0	5,01 ± 0,79	8,00 ± 0,97	47,7 ± 12,1	0,031 ± 0,006
Норваск®	166,2 ± 40,7	5,00 ± 1,04	7,94 ± 0,73	49,2 ± 16,5	0,031 ± 0,006
Исследование IIII (n=18)
Амлодипин-3	268,0 ± 111,3	6,74 ± 2,15	6,67 ± 2,38	26,9 ± 8,8	0,027 ± 0,006
Норваск®	276,7 ± 120,5	7,15 ± 2,56	7,00 ± 2,40	27,4 ± 5,4	0,028 ± 0,008
Исследование IV (n=18)
Амлорус	240,6 ± 72,7	4,48 ± 1,07	7,94 ± 1,00	37,4 ± 14,8	0,020 ± 0,004
Норваск®	246,8 ± 73,2	4,67 ± 0,94	8,28 ± 1,18	38,5 ± 14,3	0,019 ± 0,005

Достоверно значимых различий сравниваемых величин не отмечалось. Между тем, сравнительный анализ основных фармакокинетических параметров новых отечественных препаратов амлодипина и Норваска® выявил существенную межиндивидуальную вариабельность, что всегда отличает препараты, характеризующиеся полиморфизмом метаболических процессов, как и в случае амлодипина, метаболизм которого определяется полиморфизмом гена CYP3A4.

Степень относительной биодоступности препаратов амлодипина по отношению к Норваску® для двух новых отечественных препаратов представлена в таблице 2.

Значения относительных биодоступностей, рассчитанные для отношений площадей под фармакокинетической кривой (f = AUCтест/AUCреференс), для отношений максимальных концентраций (f'=(Cmax)тест/(Cmax)референс), а также значения ДИ для f и f' полностью соответствовали критериям биоэквивалентности, принятым в РФ (таблица 2). При этом отклонения от идеальной биодоступности не выходили за рамки 5%.

В соответствие с «Методическими рекомендациями по проведению качественных клинических исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов» МЗиСР РФ новые препараты амлодипина были признаны биоэквивалентными оригинальному широко применяемому препарату Норваск®. 

  Таблица 2

Значения относительной биодоступности изучаемых препаратов амлодипина  в сравнении с Норваском®

Препарат	f (%)	f’ (%)
Амлодипин-1  (n=18)	103,9 ± 11,7 (98,1 – 109,7)	104,2 ± 15,7 (96,4 – 112,0)
Амлодипин-2  (n=18)	104,6 ± 23,6 (92,9 – 116,4)	102,9 ± 20,2 (92,9 – 113,0)
Амлодипин-3  (n=18)	96,9 ± 17,6 (88,1 – 105,6)	98,3 ± 15,8 (90,5 – 106,2)
Амлорус  (n=18)	96,3 ± 14,8 (89,0 – 103,7)	98,9 ± 16,7 (90,6– 107,2)

Примечание: в скобках приведены значения ДИ.

С целью получения более полной информации и подтверждения эквивалентности новых отечественных препаратов оригиналу, параллельно с изучением фармакокинетики для Амлодипина-1, Амлодипина-3 и Амлоруса было выполнено исследование их влияния на показатели гемодинамики у здоровых добровольцев.