Сравнение влияния пассажа через кишечник пашенных червей Aporrectodea caliginosa и серых кивсяков Cylindroiulus caeruleocinctus на бактериальное сообщество (стр. 6 )

       Линейные размеры. Рост обычных или шаровидных колоний биомассы можно проследить, измеряя их линейные размеры. Так же можно использовать количество некоторого клеточного компонента.
Клеточный азот (с точностью до 1% можно определить по методу Кельдаля, однако прямая зависимость между содержанием азота и количеством биомассы наблюдается только в ограниченном диапазоне условий), белок (для определения обычно используют два метода: в основе одного лежит реакция биуретовой кислоты на пептидные связи, в основе другой - реакция тирозиновых и триптофановых остатков на реактив Фолина-Чиокальто, основанный на связывание красителя бромсульфалеина основными группами белка), ДНК ( основано на колориметрическом определение дезоксирибозы. Недостаток метода в низкой чувствительности и большими затратами времени) и др. На выбор метода измерения влияют следующие факторы:

1) свойства биомассы

2) свойства культурной жидкости

3) требуемая точность

4) требуемая чувствительность

5)требуемая скорость

Свойства биомассы, влияющие на выбор:

1) содержит ли она нити или частицы

2) легко ли отделяется от среды

3) возраст биомассы

4) скорость её роста

Экономический коэффициенты

       Образование количества биомассы Дx можно определить из количества потребленного субстрата Дs или количества образовавшегося продукта Дp.
В идеале должна существовать прямая зависимость Дx=Yx/sДs  и Дx=Yx/pДp, где экономические коэффициенты постоянны, однако этого может и не быть, если изменяются условия культивирования.

Скорость метаболических процессов.

       Количество биомассы можно соотнести со скоростью метаболического процесса. x=(1/q)(dy/dt), где q - метаболический коэффициент, dy/dt - скорость метаболического процесса, y - количество некоторого субстрата или продукта

Метод светорассеяния

       Суть метода заключается в следующем: суспензии организмов рассеивают свет и кажутся мутными, если показатель преломления организма, отличается от показателя преломления среды. Видимая мутнось начинает проявляться, когда плотность бактерий бактерий достигает 106 ед/мл. Мутность можно измерять, определяя либо количество света прошедшего через суспензию (абсорбциометрия), либо количество света, рассеянного суспензией (нефелометрия). Метод светорассеяния применим к суспензиям бактерий, дрожжей, спор и клеток млекопитающих.

       Расчет проводится по уравнению:  log(I0/It) = Axl, где x - концентрация организмов, l - длина светового пути, I0 и It - интенсивность света падающего и рассеянного соответственно. log(I0/It) - называется непрозрачностью, оптической плотностью или экстинкцией. Коэффициент А - величина постоянная при небольших концентрациях бактерий, но при больших начинает увеличиваться вследствие вторичного рассеяния, т. к. свет наталкивается больше, чем на одну частицу.

       Степень и направление рассеянного света зависит от размера и формы частиц, длины световой волны и разницы между показателем преломления частиц и среды. Эти влияния выражены в виде двух законов:
1) Общее количество света увеличивается с увеличением отношения размера частиц к длине световой волны.

2) Общее количество рассеянного света тем больше, чем больше различие между показателем преломления у частицы и среды.

Подсчёт клеток и органелл.

       Биомассу можно определить двумя путями:

1) Подсчёт общего числа индивидуальных организмов или органелл (таких, например, как ядра, присутствующие в образцах) с помощью микроскопов и некоторых электронных приборов.

2) Подсчёт жизнеспособных колоний, вырастающих из индивидуальных клеток. Недостаток метода подсчета состоит в том, что если число клеток в пробе мало, то ошибка выборки неизбежна. Преимущество метода - его специфичность и более высокая чувствительность (по сравнению с другими методами).

Подсчет живых клеток

       Наиболее важные методы, основанные на способности индивидуальных организмов к размножению и образованию колоний, которые можно подсчитать, описаны Мейнеллом и Мейнелл. Для подсчета живых клеток должны использоваться не минимальные, а богатые среды, поскольку изолированные индивидуальные клетки более требовательны к питанию, среде, чем плотная популяция в целом. С помощью метода элективных сред можно пересчитать организмы разных типов, которые присутствуют в смеси.

       Метод подсчета, основанный на разбавлении и используемый при бактериологическом анализе воды, состоит в учете не проросших разведений после высева суспензии организмов в ряд пробирок со средой. Преимущество данного метода состоит в том, что он дает возможность определять малые концентрации организмов ( < 1 клетка/мл). Однако поскольку размер пробы мал, то велика ошибка измерения. Вместо метода подсчета с помощью разбавления используется метод фильтрации через

мембранные фильтры и выращивание видимых колоний на фильтре.

Методы окрашивания

       Наиболее бесспорный метод определения числа живых и мертвых клеток состоит в сравнении числа колоний и общего числа клеток. В некоторых случаях мертвые и живые клетки могут быть дифференцированы с помощью окрашивания красителями. Живые клетки млекопитающих непроницаемы для трипанового синего, а мертвые клетки воспринимают эту окраску. Для культур дрожжевых клеток аналогично используется эозин.
Красители, окрашивающие только живые клетки, называются витальными красителями. Окрашенные клетки млекопитающих в культуре с нейтральным красным используются как количественный тест для определения клеток, переживающих вирусную атаку.

Периодическая культура.

Открытые и закрытые системы

       Культуры микроорганизмов можно подразделять на «открытые» и «закрытые» системы. Открытая система — это система, все компоненты которой могут поступать в систему и покидать ее. Закрытой называют такую систему, в которой хотя бы один из существенных компонентов не может ни поступать в систему, ни покидать ее. Следовательно, непрерывные культуры, в которых происходит, с одной стороны, приток питательной среды, с другой — отток биомассы и других продуктов, являются открытыми системами. Простая периодическая культура, содержащая ограниченное первоначальное количество питательного субстрата, служит примером закрытой системы. В закрытой системе скорость роста биомассы должна стремиться к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо из-за непереносимости продукта при его дальнейшем накоплении. Следовательно, такие системы всегда находятся в неустойчивом состоянии. В отличие от этого в открытых системах всегда есть возможность, что скорость превращения субстрата в продукты и биомассу сбалансируется со скоростью выхода, иными словами, всегда может установиться стационарное состояние.

Математическая модель простой периодической культуры.

Фазы роста простой периодической культуры представлены на рис. 1.

Рис. 1. Шесть фаз на кривой роста периодической культуры.

(I-лаг-фаза, II-фаза ускорения роста, III – фаза экспоненциального роста, IV - фаза замедления роста, V-стационарная фаза, VI-фаза отмирания)

       Если рост периодической культуры ограничен только лишь начальным количеством субстрата, то кривую роста можно предсказать, исходя из параметров роста.

dx/dt= µx,

µ= µms/(s+Ks),

x-x0=Y(s0-s)

Тогда dx/dt= µm(Ys +x0-x)x/(KsY+s0Y+x0-x)

Проинтегрировав получим

P ln(x/x0) - Q ln{(Ys0 +x0-x)/Ys0}= µmt,  где P =(KsY+s0Y+x0)/(Ys0+x0) и Q = KsY/(Ys0+x0).

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Объекты исследования

1.Зоологический объект исследования:

Пашенный червь Aporrectodea caliginosa. Кивсяк Cylindroiulus caeruleocinctus

2.Микробиологический объект исследования:

Культивируемые аэробные и факультативно анаэробные бактерии.

3.Почвенный объект:

Гумусоаккумулятивный горизонт дерново-подзолистой почвы.

2. Методы исследования.

Микробиологический анализ проводят комплексным методом. Готовятся водные суспензии (1:10) почвы (корма) и копролитов дождевого червя. Бактерии десорбируются  на вортексе «Multi Reax» фирмы Heidolph 20 мин. при 2000 об./мин. Для подавления роста грибов в суспензии добавляется антигрибной антибиотик нистатин на кончике петли. Концентрация бактерий в суспензиях определяется посевом на агаризованную глюкозо-пептоно-дрожжевую среду (ГПД) - агар-агара 15г/л, 1г глюкозы на 1 л, пептона 1г /л, дрожжевого экстракта 1г/л. Готовятся жидкие среды, содержащие 5 г/л биополимеров (крахмал, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), пектин, ксилан, казеин, декстран-500, твин-20, хитин)  и соли среды Чапека ( 2г NaNO3 на 1 л, 1г KH2PO4 на 1л, 0,5г MgSO4*6H2O на 1 л, 0,5г KCl на 1л, H2O дист, 0,1г FeSО4 на 1 л).  Среды вносятся по 100 мкл  в ячейки 96-луночной культуральной планшеты.

В ячейки вносилось по 100 мкл исследуемой супензии. Предусмотрены контроль на стерильность и на рост за счёт органического вещества суспензии. Рост ассоциаций бактерий определяется в динамике по оптической плотности при 620 нм. на иммунно-ферментном анализаторе «Sunrise» фирмы «Tecan». Температура инкубаций 25°С. По окончании инкубации состав возникших ассоциаций определяется посевом из ячеек на агаризованную ГПД среду. Одновременно по данным посева из ячеек устанавливается корреляция между оптической плотностью и концентрацией бактерий. Выросшие на плотной ГПД среде бактерии предварительно идентифицировались по культурально - морфологическим признакам.

       Поведение ассоциаций в лаг-фазе и экспоненциальный рост  описывали уравнением взятым  из синтетической хемостатной модели, упрощенной для описания периодической культуры. В данной работе теоретически интерпретировался только участок подготовки микроорганизмов к росту (лаг-фаза) и фаза экспоненциального роста на основе комплексной модели периодической культуры , которая для этих стадий роста очень близка к синтетической хемостатной модели . Эта модель может быть записана в форме системы дифференциальных уравнений