Алексей Витальевич Финкельштейн (стр. 13 )

  Начнем с первого вопроса  —  вопроса о проявлении энергии "дефекта" в статистике белковых архитектур. Но сначала усугубим его. Посмотрим, как связаны с энергией другие статистические закономерности, отмеченные в белковых структурах? Оказывается  —  точно так же! Но здесь мы располагаем большей статистикой и можем получить не только качественные, но и количественные оценки.
  Для примера рассмотрим статистику распределения аминокислотных остатков между внутренностью и поверхностью белковой глобулы и посмотрим, как она связана с гидрофобностью аминокислотных остатков. Гидрофобность аминокислотных остатков обычно измеряется в свободной энергии их переноса из октанола, моделирующего гидрофобное ядро белка, в воду. На Рис.15-6 эта гидрофобность отложена по вертикальной шкале. По горизонтальной шкале отложен логарифм отношения числа поверхностных и внутренних остатков в белках  —  точнее, этот логарифм, умноженный на RT, где Т=3000К соответствует примерно комнатной температуре. Мы видим, что точки более или менее ложатся на прямую линию  —  и наклон такой прямой более или менее близок к 1  —  1.5.
 
 
 

  Рис.15-6. Экспериментально определенная свободная энергия переноса боковых групп аминокислотных остатков из неполярного растворителя в воду (DG2), и "кажущаяся свободная энергия переноса остатка из ядра на поверхность белка" (DG1), вычисленная из наблюдаемых частот встречаемости аминокислотных остатков внутри (fin) и на поверхности (fsurf) белка по формуле  DG1 =  - RT ln[fsurf/fin]. Картинка взята из S. Miller, J. Janin, A. M.Lesk, C. Chothia, J. Mol. Biol. (1987) 196:641-656.
 
 

  Таким образом, наблюдаемая статистика распределения остатков между нутром и поверхностью глобулы неплохо аппроксимируется формулой
 

ВСТРЕЧАЕМОСТЬ ~ exp(-СВОБОДНАЯ_ЭНЕРГИЯ/kTC) ,

(15.1)

где ТС  —  какая-то температура, близкая не то к комнатной температуре, не то к характерной температуре плавления белка: ведь 3000К и 3500К совпадают "по порядку величины".
  То есть статистка встречаемости аминокислотных остатков внутри и на поверхности белка удивительно похожа на статистику Больцмана по форме! Это впервые было замечено Полем в 1971 г. для распределения углов внутреннего вращения в боковых цепях аминокислотных остатков в белках. Потом это показано и для статистики многих других элементов белковых структур: для встречаемости ионных пар, для встречаемости остатков во вторичных структурах, для встречаемости полостей в белках и т. д., и т. п. К настоящему времени эта аналогия стала столь привычной, что статистика белковых структур часто используется для оценки свободной энергии различных взаимодействий аминокислотных остатков.
  Здесь, однако, следует подчеркнуть, что белковая статистка похожа на статистику Больцмана именно по своей экспоненциальной форме, а не по физическому смыслу. Напомню, что статистика Больцмана поддерживается тем, что частицы бродят с места на место, и каждая из них больше времени проводит там, где ее энергия ниже. В то же время в нативных белках аминокислотные остатки не бродят с места на место! Например, Leu72 цепи миоглобина кашалота всегда находится внутри глобулы в нативной структуре этого белка,  —  мы никогда не видим его на поверхности. И если мы видим, по статистике, что 80-85% всех лейцинов находится внутри белка и 15-20% на поверхности,  —  то здесь дело не в том, что каждый лейцин проводит 80-85% времени внутри и 15-20% времени на поверхности глобулы. Здесь дело в том, что естественный отбор закрепил большинство лейцинов в тех точках цепи, что лежат внутри глобулы.
  То есть обычная Больцмановская статистика здесь, в распределении остатков между ядром и поверхностью белка  —  вовсе ни при чем.
  Посмотрим с другой стороны.
  Чем хорошо, скажем, преимущественное расположение лейцинов внутри глобулы?  —  Тем, что оно повышает ее стабильность. Но почему тогда естественный отбор не настоял на том, чтобы все лейцины были бы внутри белка? Может быть, потому, что уже 80-85% внутренних лейцинов достаточно для стабильности белка, а возня с остальными потребовала бы от него слишком больших усилий?

  Оставим вопрос о психологии естественного отбора как бесперспективный и ненаучный, и рассмотрим другой вопрос  —  вопрос о том, как изменяет внутренняя свободная энергия какого-то элемента белковой структуры число аминокислотных последовательностей, способных придать стабильность белку с этим структурным элементом. Например  —  сравним число стабилизирующих данную пространственную структуру последовательностей при условии, что в такой-то лежащей внутри белка точке цепи находится лейцин, с числом стабилизирующих ту же структуру последовательностей при условии, что в этой точке цепи находится серин.
  Иными словами  —  посмотрим, как изменится число стабилизирующих структуру белка последовательностей при мутации Leu ® Ser во внутренней точке белка.
  Нативная структура стабильна, если ее свободная энергия меньше, чем свободная энергия денатурированного белка. Будем, для простоты, считать, что (1) вклад остатка в стабилизацию белка определяется свободной энергией его дегидратации [что качественно справедливо, хоть может быть и не совсем верно количественно], (2) что внутренние остатки белка целиком укрыты от воды, а поверхностные - целиком ей доступны [что является довольно грубым, но качественно верным допущением], и что денатурированный белок совсем развернут [это бывает часто, но не всегда; поэтому излагаемая ниже теория приблизительна,  —  но зато она проста.]
  Свободная энергия переноса серина из гидрофобного окружения в воду  —  около 0, а лейцина  —  около +2 ккал/моль. В развернутом денатурированном белке все остатки окружены водой. Значит, структура белка с серином во внутренней точке "в среднем" (по разным последовательностям) на 2 ккал/моль менее стабильна, чем структура белка с лейцином в той же внутренней точке. Следовательно, грубо говоря, все последовательности, стабилизирующие белок с серином в ядре, будут стабилизировать и белок с лейцином в ядре,  —  но, кроме того, белок с лейцином внутри будут стабилизировать и какие-то последовательности, не способные стабилизировать белок с серином в той же точке.
  Как упадет число стабилизующих нативную структуру белка последовательностей при замене более стабильного элемента этой структуры ("Leu внутри") на менее стабильный ("Ser внутри")?

  Рассмотрим такую задачу формально и попробуем понять, откуда берется наблюдаемая, примерно экспоненциальная зависимость встречаемости разнообразных элементов от их свободной энергии, и что за температура ТС стоит в уравнении (15.1).
  Я заранее прошу меня извинить, что все выкладки я дам в самом упрощенном, а значит  —  не вполне точном виде. Моя цель  —  дать вам почувствовать, в чем суть дела, не заводя в математические дебри, по которым мы (с и ) в свое время нагулялись вволю...
  Итак, пусть De  —  свободная энергия рассматриваемого элемента в нативном белке, включая его взаимодействия с остальной цепью (например,  —  свободная энергия лейцина или серина в центре нативной глобулы), отсчитанная от его же свободной энергии в денатурированном белке. Пусть DF  —  свободная энергия всей остальной цепи в рассматриваемой пространственной структуре, за вычетом свободной энергии в денатурированном белке. Значит, De+DF  —  разность свободных энергий нативной и денатурированной форм белка. Для того, чтобы нативный белок был стабилен, DF+De должно быть меньше 0, т. е. для стабильного белка
 

DF < - De.

(15.2)

  Величины DF и De зависят от аминокислотной последовательности полипептидной цепи. Рассмотрим множество последовательностей, оставляющих неизменной величину De [в данном случае  —  все последовательности с инвариантным Leu (или Ser) в данном месте цепи; при этом, если это место лежит в ядре нативного белка, De = 2 ккал/моль для Leu и около 0 для Ser, в то время как для поверхностных остатков De близко к 0, если денатурированный белок развернут]. Величина же DF будет меняться от последовательности к последовательности.
  При этом вероятность того, что DF < - De, есть
 

(15.3)

где P(DF)  —  вероятность появления заданной величины DF в наудачу выбранной случайной последовательности.
  Величина DF складывается из свободных энергий множества разных взаимодействий и из энтропий фиксации множества разных аминокислотных остатков. Так как складываемых "случайных" величин много,  —  то, по "центральной предельной теореме" математической статистики, вероятность (P) того, что DF равна той или иной величине, имеет простую, так называемую Гауссову (см. Рис.15-7) форму:
 

P(DF) = (2ps2)-1/2 x exp[-(<DF>  —  DF)2/2s2] .

(15.4)

Здесь <DF>  —  средняя (усредненная по всем последовательностям) величина DF, а s  —  средняя (точнее  —  среднеквадратичная, усредненная по тем же последовательностям) величина отклонения DF от среднего <DF>.
 
 
 

  Рис.15-7. Типичный (Гауссов) вид распределения величины свободной энергии DF по различным случайным аминокислотным последовательностям. В DF входит вся свободная энергия укладки белковой цепи (отсчитанная от свободной энергии денатурированного белка), за исключением фиксированной свободной энергии De интересующего нас элемента структуры. Значения DF < - De (т. е. удовлетворяющие условию DF+De < 0) отвечают стабильной укладке. Зачерненная область соответствует значениям DF < - De при De > 0, "красная+зачерненная" облась  —  при De < 0. Вторая область больше, т. е. больше случайных последовательностей стабилизует укладку цепи, если свободная энергия интересующего нас элемента De < 0, чем если De > 0.
 
 

  Напомню, что "центральная предельная теорема" описывает ожидаемое распределение суммы большого числа случайных величин, и отвечает на вопрос "какова вероятность того, что эта сумма будет иметь то или иное значение?". У нас "сумма большого числа случайных величин"  —  это DF (она включает множество взаимодействий в наудачу выбранной, а значит  —  "случайной" последовательности). Так вот, математика говорит, что для большинства последовательностей величина такой суммы DF должна лежать между <DF> - s и <DF> + s, и что вероятность величины DF круто, экспоненциально падает при удалении DF от <DF> (см. Рис.15-7).
  Так как рассматриваемая укладка обычно стабильна при DF < 0 (точнее: она стабильна при DF+De<0, но одно-единственное взаимодействие, создающее De, в данном случае не в счет на фоне множества взаимодействий, создающих DF), и так как подавляющее большинство случайных последовательностей явно неспособно стабилизировать именно рассматриваемую укладку цепи (с чего вдруг,  —  именно ее из огромного числа возможных укладок?), — то величина <DF> должна быть не только положительной, но и большой  —  существенно больше, чем s (иначе  —  был бы велик, порядка 1/2, шанс, что случайная последовательность будет стабилизировать именно рассматриваемую укладку).
  Величина (<DF>  —  DF)2 = <DF>2  —  2<DF>DF  —  DF2,  —  то есть при малых (относительно большого <DF>) значениях DF, мы имеем (<DF>  —  DF)2 » <DF>2  —  2<DF>DF  —  и, значит,
 

P(DF) » {(2ps2)-1/2 x exp[ - <DF>2/2s2]} x exp[DF x (<DF>/s2)].

(15.5)

  При этом [прошу проверить  —  или (хуже!) поверить]  —  вероятность того, что DF < - De, есть
 

(15.6)

так как не зависящий от переменной DF множитель {(2ps2)-1/2 x exp[-<DF>2/2s2]} выносится за знак интеграла, а интеграл величины exp[DF x (<DF>/s2)] от "минус бесконечности" до "-De" есть (s2/<DF>) ´ exp[-De ´ (<DF>/s2)].
  Константа const = {(2ps2)-1/2 xexp[-<DF>2/2s2]} x (s2/<DF>) нас не интересует, а интересующий нас член exp[-De/(s2/<DF>)] демонстрирует, что свободная энергия (De) какого-то элемента белковой структуры экспоненциально изменяет вероятность того, что наугад выбранная аминокислотная последовательность будет стабилизировать данную укладку цепи. Таким образом, увеличение De экспоненциально уменьшает число аминокислотных последовательностей, способных придать стабильность нативной структуре, содержащей элемент с энергией De.

  Полученная зависимость имеет экспоненциальную форму (и тем она похожа на формулу Больцмана)  —  но, в отличие от формулы Больцмана, De здесь делится не на температуру среды (точнее, не на kT), а на непонятную пока величину s2/<DF>.

  Что же это за величина? Прежде всего,  —  отметим, что s2/<DF> не зависит от размера белка. В самом деле, по законам математической статистики, средняя величина (<DF>) пропорциональна числу суммируемых в DF членов (которое, в нашем случае, примерно пропорционально размеру белка), а среднеквадратичное отклонение от среднего (s) пропорционально квадратному корню из числа этих членов,  —  т. е. De2 тоже примерно пропорционально размеру белка.
  То, что s2/<DF не растет с размером белка  —  очень важно: Это значит, что величину "дефекта" De надо сравнивать  —  в формуле 15.6  —  не с полной энергией белка (которая пропорциональна его размеру), а с какой-то характерной энергией s2/<DF>, т. е. с чем-то вроде средней энергии цепи в расчете на один ее аминокислотный остаток (которая тоже не зависит от размера белка!).

  Это, вместе с экспоненциальным видом формулы 15.6, сразу отвечает на вопрос о том, почему De ценой всего в несколько ккал/моль может существенно влиять на встречаемость белковых структур (например  —  почему лейцина внутри белка на порядок больше, чем серина). Это происходит потому, что число последовательностей, стабилизующих нативную структуру белка, падает в "е" раз (примерно втрое), когда De растет на s2/<DF>.

  Итак, величина s2/<DF>  —  это что-то вроде энергии цепи в расчете на одно ее звено или на одну ее степень свободы. Или (напомню, что kT  —  это характерная тепловая энергия в расчете на степень свободы)  —  можно полагать, что s2/<DF> = kTC, где TC  —  какая-то температура. Какая? В белке есть только одна характерная температура  —  температура его плавления, денатурации. И мы все время говорили об устойчивости белка к денатурации... Поэтому можно полагать, что величина TC определяется температурой денатурации белка. Иными словами, можно предполагать, что s2/<DF> составляет примерно 0.5  —  1 ккал/моль.
  Это можно не только предполагать, но и показать. За словами "можно показать" стоит довольно сложное теорфизическое доказательство  —  теорема Шахновича-Гутина  —  от которого я вас избавлю.
  Итак, мы разобрались с вопросом о том, почему дефект ценой всего в несколько ккал/моль  —  на фоне гораздо большей полной энергии белка  —  может практически запрещать многие мотивы белковых архитектур. Потому, что "дефект" ценой в 1 ккал/моль снижает число "годных" для белка последовательностей впятеро, "дефект" ценой в 2 ккал/моль  —  раз в двадцать, и т. д.

  Теперь  —  разберемся со вторым вопросом: почему энтропийные эффекты имеют отношение к стабильности нативной структуры белка, где цепь все равно фиксирована.
  Здесь все тоже довольно просто.
  Сравним два мотива укладки цепи,  —  например, правовинтовой ход перемычки между параллельными b-участками с левовинтовым (см. Рис.15-5). Так как b-лист из L аминокислот имеет тенденцию к правопропеллерному скручиванию с углом около 30о между соседними b-тяжами (мы уже об этом много говорили и выяснили, что это связано с повышенной стабильностью скрученных b-листов), то правовинтовая перемычка как бы идет по кратчайшему пути. Поскольку b-лист скручен в ту же (правую) сторону, что и перемычка, то такой ее путь требует поворота цепи на 360o  —  30o = 330о. Другая (левовинтовая) перемычка идет как бы по обходному пути (она скручена в другую, чем b-лист, сторону), так что теперь ей приходится делать больший поворот, на 360o + 30o = 390о. Полимерная физика говорит, что чем сильнее согнута цепь, тем меньше у нее конформаций. Значит, правовинтовой (менее закрученный) ход цепи совместим с большим числом конформаций цепи, а левый (более закрученный)  —  с небольшим. Иначе говоря, "левый" ход перемычки создает "энтропийный дефект" у "левой" перемычки. Это понятно. Однако - как он проявляется на числе последовательностей, способных сделать стабильным тот или иной ход перемычки?
  Наугад выбранная аминокислотная последовательность может сделать самой стабильной структурой цепи либо какую-то одну из многих возможных конформаций, соответствующих "правой" перемычке, либо какую-то из немногих, отвечающих "левой" перемычке,  —  либо, наконец, она не способна сделать самой стабильной ни одну из этих конформаций. Последнее, конечно, наиболее вероятно, так как на опыте случайно сваренные сополимеры аминокислот не имеют стабильной трехмерной структуры. Однако, если выбирать из двух: какая перемычка все же имеет больший шанс стать самой стабильной  —  правая или левая?
  Каждая отдельная конформация с "правой" перемычкой ничуть не лучше и не хуже, чем каждая отдельная конформация с "левой" перемычкой,  —  если они имеют равную компактность, одинаковое содержание вторичной структуры и т. д. Однако "правых" конформаций больше... Итак, мы видим, что перед нами  —  нечто вроде лотереи с малым шансом на выигрыш главного приза ("приз"  —  возможность создать стабильную трехмерную структуру),  —  лотереи, где "правая" перемычка имеет много "билетов" (возможных конформаций), а левая  —  мало. Кому же, скорее, достанется приз  —  если он вообще кому-то достанется? Конечно, "правой" перемычке,  —  той, у кого "билетов" больше: вероятность победы той или иной перемычки прямо пропорциональна числу имеющихся на руках "билетов"  —  конформаций...
  Иными словами,  —  шанс на то, что случайная аминокислотная последовательность сделает стабильной какую-то из многих конформаций "правой" перемычки, относится к шансу на то, что она сделает стабильной какую-то из немногих "левых" конформаций, как число "правых" конформаций относится к числу "левых". Или: чем шире набор возможных конформаций (а их больше у "правой" перемычки),  —  тем больше последовательностей найдет в этом наборе свою самую стабильную структуру. При этом каждая из таких последовательностей выберет из этого набора одну, наиболее подходящую именно для нее конформацию.
  Именно это и наблюдается в глобулярных белках: здесь "правый" ход перемычки  —  правило, а "левый"  —  исключение.

  Рассмотрим еще одну задачу, связанную с энтропийными дефектами. Что должно чаще наблюдаться: белки, через центр которых проходит слой a-спиралей, или белки, через центр которых проходит b-лист?
  Ожидаемый ответ дан на Рис.15-8, и он гласит, что глобулы, через центр которых проходит b-лист, стабилизируются гораздо большим числом первичных структур, чем глобулы с a-спиралью по центру.
 
 
 

  Рис.15-8. Многослойная упаковка, в центре которой лежит a-спираль, должна быть менее вероятна (и на самом деле встречается гораздо реже), чем многослойная упаковка, в центре которой лежат два b-участка. Дело в том, что лежащий в центре глобулы участок должен состоять из одних гидрофобных остатков, причем длина такого структурного участка диктуется диаметром глобулы,  —  а, при равной длине, a-спираль состоит из вдвое большего числа остатков, чем вытянутый b-тяж; поэтому для создания внутренней a-спирали (одного большого блока из гидрофобных групп) нужна более "редкая" последовательность, чем для создания двух внутренних b-участков (двух вдвое меньших гидрофобных блоков, как-то расположенных в цепи). Вероятность существования одного большого (из m остатков) гидрофобного блока в данном месте случайной цепи,  —  порядка pm (где p  —  доля гидрофобных остатков в цепи); и такова же вероятность существования двух вдвое меньших блоков в двух данных местах случайной цепи,  —  (pm/2)x(pm/2) = pm. Однако один блок может размещаться в цепи из N остатков примерно N способами, а способов разместить два блока много больше  —  примерно NxN/2, т. е. цепей с двумя короткими блоками много больше, чем цепей с одним длинным блоком.
 
 
 

  И действительно, внутренняя a-спираль в белках очень редка (в качестве известного носителя такого редчайшего признака назову "зеленый флуоресцентный белок"), а внутренние b-тяжи  —  типичны (например, в "укладках Россманна").

  С той же точки зрения  —  "насколько часто данная структурная деталь стабилизируется случайными аминокислотными последовательностями?"  —  можно объяснить и многие другие закономерности, наблюдаемые в глобулярных белках. Например  —  средний размер домена для цепи с заданным соотношением гидрофобных и гидрофильных групп (этот вопрос исследовался еще ленинградскими учеными Бреслером и Талмудом 1944 г., а затем Фишером в США), а также,  —  средние длины a-спиралей, b-участков и нерегулярных петель.

  Итак, наш анализ показывает, что вероятность структурного элемента в стабильной (т. е. наблюдаемой) белковой глобуле должна быть тем больше, чем ниже его энергия и чем большим числом конформаций его можно создать.
  А так как энергия и число конформаций объединяются в единое целое в свободной энергии,  —  то статистика наблюдения самых разных элементов белковых структур в белках должна иметь вид

  ВСТРЕЧАЕМОСТЬ ~ exp(—СВОБОДНАЯ_ЭНЕРГИЯ/kTC) ,

где TC близка (не в точности равна, как показывает более тщательный анализ, но близка) к температуре денатурации белка.
  И действительно, белковая статистика, в общем, имеет такой вид!

  Еще раз напомню физическую причину такого соотношения. Она заключается в том, что свободная энергия элемента белковой структуры экспоненциально изменяет число аминокислотных последовательностей, способных придать стабильность белку, нативная структура которого содержит этот элемент. Если этот элемент сам по себе стабилен  —  белок с ним "терпит" много даже неблагоприятных мутаций, т. е. довольно много аминокислотных цепей стабилизируют белок с этим элементом. Если же этот элемент нестабилен  —  белок с ним требует очень тщательного подбора своей первичной структуры (стабильность его структуры легко разрушается даже немногими мутациями), а таких "тщательно отобранных" последовательностей  —  мало.
  Здесь нужно подчеркнуть, что так называемые "запрещенные", т. е. не наблюдаемые (или редко наблюдаемые) в белках структуры не невозможны в принципе  —  они просто маловероятны, т. е. создаются малым числом аминокислотных последовательностей.

  Заключительные замечания:

  1. Мотивы укладки белковой цепи выглядят так "стандартно",т. е. так просто и регулярно потому, что каркас белковой структуры представляет собой компактную упаковку слоев вытянутых регулярных твердых тел (a-спиралей и b-участков), а нерегулярные перемычки идут по поверхности глобулы, не пересекая ни друг друга, ни торцов структурных сегментов. Физическая причина такого устройства  —  в том, что оно наиболее благоприятствует стабильности нативной глобулы, позволяя неполярным боковым группам укрываться от воды, а всем пептидным группам главной цепи  —  насытить свои водородные связи даже при погружении в компактную глобулу.
  2. Число таких "стандартных" стабильных мотивов укладки цепи относительно невелико (порядка сотен, а белков  —  многие тысячи); неудивительно поэтому, что некоторые из этих "стандартных" структур встречаются в разных, со всех остальных точек зрения, белках.
  3. По-видимому, для структур доменов глобулярных белков можно сформулировать "принцип множественности": чем больше аминокислотных последовательностей можно вписать в данную архитектуру без разрушения ее стабильности, тем чаще эта архитектура встречается в природе.

  Похоже, что глобулярные белки могли относительно легко возникнуть из случайных гетерополимеров аминокислот  —  нужно было только немного, при помощи немногих мутаций стабилизировать самую стабильную пространственную структуру исходного случайного полипептида (и тем самым сделать ее единственной наблюдаемой структурой цепи),  —  да еще "навесить" активный центр.
  Я специально подчеркиваю,  —  "принцип множественности" можно сформулировать именно для глобулярных белков, так как именно их последовательности внешне напоминают "случайные" (т. е. самые массовые) сополимеры (Рис.15-2). В то же время для первичных структур фибриллярных и мембранных белков ясно просматривается их "неслучайное" строение (но  —  кстати: строение, также простое с точки зрения его создания,  —  периодическое для фибриллярных, и блочное  —  для мембранных белков).

  Проведенный анализ подчеркивает тот факт, что получающиеся в результате эволюции структуры белков выглядят очень "разумно" с физической точки зрения,  —  так же, как и двойная спираль ДНК, как и мембранный бислой. Видимо, и на уровне архитектур белковых доменов эволюция не "изобретает" нечто физически маловероятное, а "выбирает" среди физически разумных (т. е. стабильных и способных к быстрой самоорганизации  —  мы это скоро увидим) структур. В этом и заключается смысл "физического отбора" белковых структур.

Лекция 16

  Ранее мы рассматривали стабильность фиксированных, "твердых" белковых структур. Но  —  при определенных внешних условиях  —  самой стабильной может оказаться не твердая, а расплавленная или даже развернутая форма белковой молекулы. Тогда белок "денатурирует", теряет свою нативную, "рабочую" структуру.
  Обычно денатурация белка наблюдается in vitro, при воздействии на него аномальной температуры или денатуранта [мочевины, H+ или OH—  ионов (т. е. аномального рН) и т. д.]. Однако распад "твердой" структуры белка и затем ее повторная самоорганизация происходит и в живой клетке  —  что играет важную роль, например, в процессе транспорта белков через мембраны.
  Денатурация и ренатурация глобулярных белков in vitro  —  объект интенсивных исследований, интерес к которым поддерживается их связью с проблемой самоорганизации белка, т. е. с вопросом о том, как белковая цепь находит свою уникальную структуру среди гигантского числа возможных альтернатив. Сегодня я практически не буду касаться кинетических аспектов денатурации и самоорганизации белков и сосредоточусь на термодинамических и структурных аспектах этих явлений.
  Больше всего изучены водорастворимые глобулярные белки, и именно о них я буду рассказывать.

  Что показывает эксперимент?
  Твердо установлено, что денатурация малых белков является кооперативным переходом с одновременным и резким, "S-образным" изменением многих (хотя порой и не всех) характеристик молекулы (Рис.16-1). S-образность экспериментальных кривых показывает, что соответствующие характеристики молекулы меняются от тех, что характерны для нативного белка, до тех, что характерны для белка денатурированного; а узость этих S-образных кривых свидетельствует о кооперативности перехода, т. е. о том, что он охватывает сразу много аминокислотных остатков.
 
 

а	б

  Рис.16-1. Денатурация белка сопровождается резким, "S-образным" изменением многих характеристик молекулы. (а) Синхронное изменение КД () [длина волны  —  220 нм] и флуоресценции () при денатурации фосфоглицераткиназы в растворе гуанидингидрохлорида. (б) Электрофорез цитохрома с при разных концентрациях мочевины: замедление миграции вызвано разбуханием молекулы при денатурации. Картинки взяты из [6].
 

  Более того: денатурация белка происходит как переход типа "все-или-ничего" (Рис.16-2).
 
 

Рис.16-2. Калориметрическое исследование тепловой денатурации лизоцима при разных рН. Положение пика удельной теплоемкости (Ср) определяет температуру T0, его ширина  —  ширину перехода DT, площадь под пиком  —  поглощенное при плавлении тепло DН в расчете на грамм белка. То, что они удовлетворяют условиям (16.4), (16.5), свидетельствует, что денатурация происходит как переход типа "все или ничего". Увеличенная теплоемкость денатурированного белка  —  следствие увеличения поверхности контакта его гидрофобных боковых групп с водой при (частичном или полном) разворачивании белка. Картинка взята из P. L.Privalov & N. N.Khechinashvili, J. Mol. Biol. (1974) 86:665-684.

 

  Последнее (вы должны это помнить) означает, что при таком переходе только начальное (нативное) и конечное (денатурированное) состояние наблюдаются в заметных количествах (Рис.16-3), а "полуденатурированных" молекул практически нет. [Хотя, конечно, они тоже должны быть, пусть в мизерном количестве,  —  ведь не переходит же одно состояние в другое при помощи нуль-транспортировки; но наличие "полусвернутых" структур отражается только на кинетике перехода, разговор о которой еще впереди.] Иначе говоря, переход "все-или-ничего" является микроскопическим аналогом фазового перехода первого рода в макроскопических системах (например  —  плавления кристалла). Однако  —  в отличие от истинного фазового перехода  —  S-образность перехода "все-или-ничего" имеет не нулевую, а конечную ширину, так как этот переход охватывает не макроскопическую, а микроскопическую, очень небольшую систему.
 
 

  Рис.16-3. При одном и том же виде зависимости энергии Е (или другого наблюдаемого параметра) от температуры, кооперативный ("S-образный") переход может быть и переходом типа "все-или-ничего" (пример: денатурация белка), и постепенным, "безродным" (пример: переход спираль-клубок в полипептидах). Различия проявляются не в виде кривой Е(Т), а в функции распределения W(E) молекул по энергии (или по другому наблюдаемому параметру). Пунктирные линии на левом рисунке поясняют графическое определение DT, температурной ширины перехода.