Молекулярные основы наследственности (стр. 2 )

У животных сигнальными веществами являются различные гормоны, В клетках вырабатывается специфический белок-ре­цептор, обладающий способностью связываться с гормоном, ко­торый приобретает свойство индуцировать работу одного или нескольких генов, Наиболее изучен этот процесс для половых гормонов, В настоящее время обнаружены и другие сигнальные вещества, так называемые эмбриональные индукторы, а также вещества, попадающие в организм извне.

У эукариот возможна регуляция синтеза белков на уровне трансляции, При этом имеют значение типы тРНК и ферментов, активирующих соответствующие аминокислоты, а также вырож­денность генетического кода. Большая часть аминокислот коди­руется несколькими кодонами, получившими названия изоакцепторных кодонов. Одна и та же аминокислота может достав­ляться на мРНК несколькими типами тРНК. Так, кодирование аминокислоты лейцина может происходить посредством кодо­нов ЦУЦ, ЦУУ, ЦУГ. Процесс трансляции зависит также от со­стояния тРНК, рибосом, наличия или отсутствия соответствую­щих ферментов, в том числе и способных модифицировать гото­вые белковые молекулы.

Из приведенного следует, что молекула ДНК в процессе биосинтеза осуществляет реализацию наследственной информа­ции. Этот процесс, несмотря на некоторые особенности, харак­терные для прокариот и эукариот, является, по сути, единым для всего органического мира путем воплощения наследствен­ной информации в свойства и признаки.

Современное представление о гене как единице наследствен­ности. В представлении Г. Менделя единицей наследственности был фактор, контролирующий проявление в доминантном или рецессивном состоянии одного признака. В дальнейшем поня­тия о гене были развиты в работах Т. Моргана, который пока­зал, что ген — это локус (участок) хромосомы, занимающий в ней строго определенное положение.

В современном понимании ген — это функциональная едини­ца молекулы ДНК, контролирующая последовательность аминокислот в кодируемой полипептидной цепи. Специфичность гена определяется числом нуклеотидов и их уникальной последова­тельностью. Ген имеет определенную величину, выраженную чис­лом нуклеотидов и молекулярной массой. Ген, кодирующий син­тез полипептидной цепи, называется структурным. Он является составной частью оперона, имеет сложную систему регуляции, осуществляемой акцепторными генами. Для каждого структур­ного гена характерна уникальная последовательность нуклео­тидов, позволяющая его идентифицировать.

Структурный ген является дискретной целостной еди­ницей, кодирующей синтез одной полипептидной цепи. Любое изменение порядка чередования нуклеотидов — выпадение, до­бавление или замена хотя бы одного нуклеотида — инактивирует структурный ген или изменяет его функцию.

Ранее отмечено, что для структурных генов эукариот харак­терно мозаичное строение (рис. 40): участки молекулы ДНК, кодирующие аминокислоты в полипептидной цепи, — экзоны (кДНК) чередуются с участками, которые не обладают этой способностью, — нитронами.

Акцепторные гены каждого оперона обладают высо­кой специфичностью — к ним могут присоединяться только опре­деленные молекулы белка, в том числе белок-репрессор, подав­ляющий активность структурных генов, Cap-белок, а также ферментативное белки, обеспечивающие репликацию и транскрипцию. Доля структурных и акцепторных генов в общей ДНК в геномах разных организмов колеблется от 98 до 15%. Осталь­ная часть ДНК генома получила название избыточной ДНК. Особенно много избыточной ДНК содержится 8 геномах расте­ний. Для избыточной ДНК характерно наличие повторов — оди­наковых последовательностей нуклеотидов. Р. Бриттен и Д. Кон в 1968 г. установили, что у мыши 70% ДНК составляют уни­кальные последовательности нуклеотидов, а 30% — повторы; у человека — 66% уникальные последовательности, а 34% — повторы.

Повторы ДНК у эукариот могут иметь различную природу. Некоторые структурные гены, имеющие уникальную последова­тельность нуклеотидов, могут быть представлены несколькими копиями. Гены, кодирующие гистоны — основные белки, входя­щие в состав хромосом, в молекуле ДНК представлены различ­ным числом копий, например, в гаплоидном геноме мыши со­держится 30 структурных генов, кодирующих гистон Н4. У жи­вотных имеются повторы структурных генов, кодирующих гло­бин, иммуноглобулин, интерферон и другие жизненно важные молекулы белка. Среди повторов генов имеются нефункционирующие гены, которые из-за выпадения или добавления нуклеоти-да потеряли способность синтезировать мРНК. Их называют псевдогенами.

Особенно многократно в молекуле ДНК встречаются повто­ры структурных генов, контролирующих синтез рибосомальной и транспортной РНК. Так, в гаплоидном геноме лягушки име­ется около 8000 генов тРНК, в геноме курицы — около 100 ге­нов рРНК, в геноме дрозофилы их около 130.

В ДНК геномов содержатся и другого рода повторы. Они представляют собой короткие последовательности нуклеотидов, каждый из них содержит около 300 нуклеотидных пар, а также 40000—80000 повторов В1, содержащих приблизительно по 140 нуклеотидных пар.

В составе избыточной ДНК у эукариот в довольно большом количестве содержатся последовательности нуклеотидов, гене­тическая роль которых пока еще остается невыясненной. Они получили название сателлитной ДНК, которая представляет со­бой последовательности, состоящие из нескольким нуклеотид­ных пар. У мыши они состоят из 6 пар нуклеотидов, в том чис­ле 5 пар AT и пары ЦГ; у морской свинки сателлитная ДНК состоит из 6 пар нуклеотидов, в том числе 3 пар ЦГ и 3 пар ТА, АГ и AT. Блоки (кластеры) сателлитной ДНК преимуществен­но сосредоточены в гетерохроматиновых районах хррмосом, рас­положенных около центромеры.

Транспозоны. В течение длительного времени счита­лось, что положение генов в хромосоме и, следовательно, в молекуле ДНК является строго фиксированным, хотя Б. Мак-Клинток еще в 1953 г. доказала, что в геноме кукурузы содержатся так называемые подвижные генетические элементы. В 1975—1977 гг. советский ученый обнаружил в геноме дрозофилы гены, представленные десятками копий и рассеянные по разным хромосомам. Им было установлено, что эти гены являются подвижными или «прыгающими», так как мо­гут быть локализованы у разных линий и даже у отдельных особей в разных хромосомах и в разных локусах одной хромо­сомы.

Перемещение фрагмента ДНК, содержащего ген или гены, из одной хромосомы в другую, им несвойственную, называется транспозицией. Фрагменты ДНК, способные перемещаться из одной хромосомы в другую или из одного локуса в другой на­зывают транспозонами. Транспозиция включает два процесса: эксцизию и инсерцию. Эксцизией называется освобождение транспозона из молекулы ДНК, в которую он был встроен, а инсерцией — процесс встраивания транспозона в новый локус ДНК.

Транспозоны условно можно разделить на несколько клас­сов. Один из них, наиболее изученный и широко представлен­ный, обнаружил у дрозофилы и назвал их «мо­бильные диспергированные гены» (МДГ). У дрозофилы имеется около 20 семейств таких МДГ, каждое из которых содержит от 10 до 150 копий, локализация которых в геноме сильно варьи­рует. Характерной особенностью МДГ являются одинаково ори­ентированные длинные концевые повторы (ДКП). ДНК МДГ содержит 5—10 тыс. нуклеотидных пар, в том числе 250—1500 нуклеотидных пар — это ДКП. Образование большого числа ко­пий МДГ происходит следующим образом: на матрице ДНК в локусе МДГ-элемента синтезируется РНК, на которой при уча­стии фермента обратной транскриптазы образуется много ко­пий фрагментов ДНК, соответствующих МДГ, которые внед­ряются в новые локусы ДНК генома. В ДКП МДГ-элементов имеются сигнальные последовательности для начала и оконча­ния транскрипции, а также усилители (энхансеры), резко уве­личивающие интенсивность транскрипции. Они содержат также оперон, кодирующий обратную транскриптазу.

Другой класс активных транспозонов (МДГ) включает по­следовательности ДНК, кодирующие фермент транспозазу, ко­торый отвечает за транспозицию МДГ — вырезание и встраива­ние транспозонов. К ним относят хорошо изученные Р-элемент дрозофилы и Ас-элемент кукурузы.

К особому классу можно отнести пассивные транспозоны — фрагменты ДНК, которые ничего не кодируют, но многочислен­ные копии которых могут служить субстратом для транспозазы. К их числу могут быть отнесены и длинные обращенные повторы, и даже некоторые МДГ-элементы.

К транспозонам относят также и другие участки генома, если они активно синтезируют РНК, а затем при участии фер­мента ревертазы образуют многочисленные копии ДНК, кото-рые вставляются в различные участки генома. К их числу отно­сятся два класса коротких транспозонов мыши, названные В1 и В2; В1 содержит 130, В2— 190 пар нуклеотидов. Они рассея­ны по всему геному, и почти в каждом фрагменте ДНК содер­жится В1 или В2, или оба. Находясь в ДНК генома, они актив­но транскрибируют РНК, а затем при участии обратной транскриптазы образуют огромное число копий (в клетке может со­держаться до копий каждого транспозона).

В геноме человека также обнаружены В1 и В2, а также транспозон А1и содержащий 300 пар нуклеотидов и представ­ленный копиями.

Транспозиция играет значительную роль в реализации на­следственной информации и может быть причиной наследствен­ного изменения признака (мутации). Многие транспозоны слу­жат матрицами для транскрипции мРНК, кодирующей различ­ные ферменты, в том числе обратную транскриптазу. Внедряясь в новые локусы генетического аппарата клетки, транспозоны влияют на работу окружающих генов. Иногда внедрившийся транспозон изменяет структуру гена вплоть до создания нового, несвойственного данному локусу. Транспозоны могут вызвать глубокие перестройки генома, в том числе делеции, инверсии, транслокации. Для разных генетических локусов от 10 до 90% всех спонтанных мутаций являются результатом транспозиции МГД.

В обычных условиях транспозиция происходит весьма редко, но под действием некоторых факторов наблюдаются так назы­ваемые транспозиционные взрывы, когда в клетке сразу переме­щается большое число транспозонов, относящихся к разным классам.

В последние годы установлено, что транспозиция и образо­вание большого числа повторов МДГ сходны с ретровирусами птиц и млекопитающих. Ретровирусами называют вирусы; у ко­торых генетическая информация записана на РНК (РНК-содержащие вирусы). Когда такой РНК-содержащий вирус про­никает в клетку, при участии фермента обратной транскриптазы синтезируются ДНК-копии РНК вируса. ДНК внедряется в различные локусы генома клетки и становится составной частью молекулы ДНК. Такую ДНК называют провирусом. В геноме мыши может содержаться несколько семейств провирусов, лока­лизованных в разных локусах ДНК. На этих ДНК может синте­зироваться РНК и даже могут образовываться вирусоподобные частицы, но инфекционный вирус не возникает. Вирусы, инфор­мация о которых содержится в ДНК высших организмов, полу­чили название эндогенных вирусов (ЭВ), а кодирующие их ге­нетические элементы — эндогенных провирусов (ЭП). Так, у кур выявлено 29 локусов ЭП, которые встречаются в различных со­четаниях и с разной частотой. Ни один из локусов ЭП не явля­ется обязательным элементом генома кур.

Подавляющее большинство ЭП дефектны и не могут коди­ровать вирионы, поэтому они не являются инфекционными для родительских клеток. Вместе с тем некоторые ЭП следует рас­сматривать как генетические факторы риска, повышающие ве­роятность начала канцерогенного процесса или появления ново­го онкогенного вируса.

Контрольные вопросы. 1. Каким образом ДНК сохраняет, передает и реа­лизует наследственную информацию? 2. Какую функцию выполняет каждый входящий в оперон фрагмент ДНК? 3. Свойства генетического кода 4. Что такое «ген» в современном понятии? Функции и свойства генов различных ти­пов. 5. Как осуществляется синтез и выделение генов? 6. Народнохозяйствен­ное значение генетической инженерии.

ГЛАВА 8. БИОТЕХНОЛОГИЯ

И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Термин «биотехнология» появился в середине 70-х годов в свя­зи с успехами в области генетической инженерии, биохимии, микробиологии и других смежных областей биологической нау­ки. Современная биотехнология представляет собой новую форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты — животные, растения, ткани различных органов, соматические клетки, размножаемые вне организма, микроорганизмы — бактерии, грибы. В основе биотехнологии — генетическая инженерия.

Генетической инженерией называют область молекулярной генетики, разрабатывающую методы конструирования новых функционально активных генетических программ. Датой за­рождения генетической инженерии принято считать 1972 г., когда П. Берг с сотрудниками (США) создали первую реком-бинантную молекулу ДНК. Она состояла из фрагмента ДНК, взятого у обезьяньего вируса ОВ40, и бактериофага λ с галактозным опероном Е. colt. Важную роль в генетической инжене­рии играют ферменты, с помощью которых можно получать оп­ределенные фрагменты ДНК исшивать их, например рестриктазы (рестригирующие эндонуклеазы) и лигазы, которые лишены видовой специфичности, поэтому можно получать фрагменты ДНК и сшивать их независимо от того, из одного или разных организмов они выделены. Большое значение для развития ге­нетической инженерии имеет метод секвенирования (расшиф­ровки) первичной структуры ДНК, разработанный в 1977 г. Ф. Сенджером и У. Гильбертом. Этот метод позволяет опреде­лить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК с пре­дельным разрешением в один нуклеотид.

Генетическая инженерия как метод конструирования гене­тических программ включает ряд сложных приемов, объединяю­щих усилия биохимиков, генетиков, микробиологов:

синтез или выделение соответствующего гена (или генов);

включение данного гена в вектор, обеспечивающий его раз­множение (клонирование);

трансгеноз — перенос гена с помощью вектора в клетку-рециент и включение в ее геном;

функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация гена).

Синтез генов. Впервые химический синтез гена осуществил в 1969 г. работающий в США индийский ученый X. Г. Корана с сотрудниками. Он синтезировал ген (участок молекулы ДНК), кодирующий синтез аланиновой тРНК пекарских дрож­жей. Этот ген состоит из 77 пар нуклеотидов, последователь­ность которых была известна. Вначале синтезировали мелкие фрагменты ДНК, содержащие от 4 до 13 нуклеотидных пар, за­тем с помощью фермента лигазы их соединили в соответствую­щем порядке, но данный ген был не в состоянии синтезиро­вать аланиновую тРНК так как не содержал акцепторной системы.

В 1976 г. в лаборатории X. Г. Кораны был синтезирован фрагмент ДНК, включающий структурный ген супрессорной тирозиновой тРНК длиной 126 пар нуклеотидов, промотор, состоя­щий из 52 пар нуклеотидов, и терминатор, имеющий 21 пару нуклеотидов. К концам молекулы ДНК были прикреплены так называемые «липкие концы», состоящие из чередования нуклео­тидов ААТТ (один конец) и ТТАА (другой конец). Благодаря этому данный ген был встроен в геном фага и нормально в нем функционировал. Таким образом, была показана возможность искусственного синтеза генов. Метод позволяет синтезировать относительно мелкие гены, содержащие небольшое число пар нуклеотидов. Гены, кодирующие ферменты или структурные белки, состоящие из тысячи и более нуклеотидных пар, рацио­нальнее создавать методом ферментативного синтеза с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы). С помощью данного фермента с мРНК могут быть получены точные копии ДНК (кДНК).

Ферментативный синтез может быть схематично представ­лен следующим образом. В пробирку, содержащую физиологи­ческую бесклеточную среду, вносят дезоксинуклеотидтрифосфаты всех четырех типов (А, Г, Т, Ц), фермент ревертазу, мРИК, кодированную природным геном, копию которого планируется получить. В качестве «затравки», ускоряющей реакцию, вносят небольшие участки молекулы ДНК, содержащие 8 — 10 повторов тимина. На мРНК обратная транскриптаза синтезирует комп­лементарную ей нить ДНК. Затем на синтезированной нити ДНК строится вторая комплементарная нить ДНК. В результа­те получают фрагмент двойной спирали ДНК — точную копию того гена, с которого была транскрибирована мРНК (рис. 41).

Описанным способом были синтезированы гены, кодирующие глобины человека, кролика, мыши, утки, голубя, иммуноглобу­лин мыши, белок хрусталика глаза быка, яичный белок и дру­гие. Подобным образом можно синтезировать структурные гены, не содержащие регуляторную часть оперона, что ограничивает их функционирование.

Выделение генов. Впервые выделить ген методом трансдукции удалось Дж. Бексвиту с сотрудниками. Они показали, что бактериофаг λ при размножении в клетке Е. coli может захва­тить и встроить в свой геном полный лактозный оперон бакте­рии вместе с примыкающим к нему геном-регулятором. Фраг­мент ДНК Е. coli встраивается 8 геном фага к в строгом поряд­ке: структурные гены z, а, у, оператор — о, промотор р и регу­лятор i. Применением денатурации и центрифугирования из ДНК-фага был выделен лактозный оперон и ген-регулятор E. coli. К сожалению, метод оказался сугубо специфичным для данного гена и не может широко использоваться в генетической инженерии. В настоящее время генетическая инженерия ис­пользует методы, позволяющие одновременно выделить из моле­кулы ДНК фрагмент соответствующего гена и встроить его в вектор, посредством которого он может быть размножен и включен в геном клетки-реципиента.

Фрагменты ДНК, содержащие ген, чаще всего получают с помощью ферментов — рестриктаз. Эти ферменты разрезают молекулу ДНК в строго определенном месте, где находятся нуклеотиды, распознаваемые данной рестриктазой. Например, рестриктаза EcoPI разрезает нить ДНК между аденином и гуа­нином, находящимися в следующей последовательности. Г. ААТТ или ТТАА. Г (точка указывает место разрезания ДНК). При этом образуются «липкие концы» — комплементарные друг другу последовательности нуклеотидов — ААТТ и ТТАА, благо­даря чему они могут соединяться.

Векторами могут быть плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды. Векторы включают фрагменты ДНК, соответствующие определенному гену, и переносят их в клетку-реципиент.

Плазмиды — мелкие кольцевые молекулы ДНК, присутству­ющие в клетках бактерий. Они содержат дополнительную ге­нетическую информацию, способны автономно, независимо от ДНК хромосом, реплицироваться; некоторые плазмиды облада­ют способностью встраиваться в хромосому бактерии и выхо­дить из нее; некоторые могут переходить из одной клетки в другую. В генетической инженерии наиболее широко используются 3 типа плазмид, обозначаемые символами F, Р и Col.

В качестве вектора используют так называемые рекомбинантные (гибридные) плазмиды, в ДНК которых включены ге­ны, выделенные из ДНК прокариот или эукариот. Метод созда­ния рекомбинантных плазмид — векторов был разработан П. Бергом с сотрудниками в 1972 г. Ими была создана рекомбинанрная плазмида, содержащая галактозный оперон Е. coli. В настоящее время известно более 30 систем, позволяющих по­лучать различные векторы. Примером создания рекомбинант­ных плазмид может быть следующий метод. ДНК плазмиды (например, ПБР 322) и ДНК интересующего исследователя ор­ганизма обрабатывают ферментом рестриктазой (например, Бам 1), которая образует разрывы ДНК в строго определен­ных местах с образованием липких концов. Затем оба препара­та смешивают, фрагменты ДНК плазмиды и ДНК донора со­единяются липкими концами и образуется рекомбинантная мо­лекула ДНК. На соответствующих селективных средах отбира­ют рекомбинантные плазмиды, содержащие соответствующий ген.

Д. Хелинский с сотрудниками в 1974 г. включил гены, коди­рующие синтез аминокислоты триптофана в ДНК плазмиды ColEl, и перенес рекомбинантную плазмиду в клетки кишечной палочки Е. coli. Затем бактерию обработали хлорамфениколом; число копий данной рекомбинантной плазмиды увеличи­лось до 400—500 на одну клетку, и она стала суперпродуцентом аминокислоты триптофана. Таким путем были созданы штаммы бактерий-суперпродуцентов вакцин к вирусам гепатита В, ящу­ра, гриппа, аденовирусу и др.

В плазмиду могут быть включены природные или синтезиро­ванные гены. После проникновения в клетку бактерии рекомбинантная плазмида может функционировать и размножаться ав­тономно либо включаться в ДНК хромосомы бактерии. Таким методом в клетки бактерий были введены гены человека и со­зданы штаммы бактерий-суперпродуцентов соматостатина, ин­терферона, брадикинина, гормоны роста человека, быка и дру­гих животных, глобин животных и человека (рис. 42).

В 1980 г. с помощью плазмиды в клетки Е. coli был введен ген, контролирующий синтез инсулина человека. Для этого из клеток человека была выделена зрелая мрРНК, кодирующая синтез инсулина. С помощью обратной транскриптазы с этой мРНК была получена комплементарная копия — кДНК. Це­почка мРНК была разрушена и с помощью фермента ДНК-полимеразы синтезировали вторую комплементарную нить ДНК. Чтобы синтезированный ген можно было встроить в вектор, к его концу с помощью фермента лигазы были «пришиты» короткие нуклеотидные последовательности — линкеры, которые узнаются рестриктазой Бам 1. Плазмиду и кДНК обрабатыва­ют рестриктазой Бам 1, затем ферментом лигазой и получают рекомбинантную плазмиду, которую вводят в клетку бакте­рии, приобретающей способность синтезировать про-инсулин.

Вирусы часто используют в качестве векторов, проникаю­щих в животные клетки. Наиболее широко в генетической инже­нерии используют обезьяний онкогенный вирус ОВ40 (SV40). Он относится к мелким вирусам, его ДНК состоит из 5200 нуклеотидных пар. Геном этого вируса обладает способностью встраиваться в хромосомы клеток млекопитающих. Иногда ви­рус ОВ40 превращается в вирион, в котором внутри белковой оболочки (капсиды) содержится не ДНК вируса, а ДНК клет­ки-хозяина. С помощью ОВ40 гены β-цепи гемоглобина мыши и кролика были перенесены в клетки обезьян, где они активно функционировали.

Космиды — векторы, полученные путем объединения неболь­ших фрагментов ДНК бактериофага λ и плазмид. Космиды содержат гены, обеспечивающие их размножение в бактерии, ген устойчивости к антибиотику тетрациклину и особый участок из фага λ под названием «кос», который содержит все вещества, необходимые для упаковки рекомбинантной ДНК в белковую головку фага. Космида состоит из 35— 40 тыс. нуклеотидных пар. С помощью этих векторов гены могут быть перенесены в бактериальные, растительные и животные клетки, культивируе­мые in vitro.

Большой интерес представляет перенос генов непосредствен­но в клетки животных, но эта проблема находится пока еще в стадии разработки. В 1982 г. Р. Палмиттер с сотрудниками ввел в мужской пронуклеус оплодотворенных яиц мыши ген гор­мона роста крысы. Вектором служила рекомбинантная плазмида pMGH, с которой был соединен ген. Ген гормона роста кры­сы содержит 353 нуклеотидных пары ДНК. Он был введен в ви­де раствора, содержащего около 600 копий рекомбинантной плазмиды, в 170 яйцеклеток мыши, которые затем были транс­плантированы в матки мышей-воспитательниц. Была получена 21 особь, шесть из них проявили гигантизм. В клетках печени гигантских особей содержалось большое количество молекул мРНК, кодирующих синтез гормона роста, а в крови отмечена высокая концентрация этого гормона.

Все увеличивающееся количество данных о расшифровке куклеотидной последовательности в ДНК на участках соответствующих генов обусловило необходимость создания специальных автоматизированных систем для их хранения и обработки. Такие системы созданы у нас в стране, в США и во многих странах Западной Европы.

Генетическая инженерия на уровне хромосом и геномов. Од­ним из разделов генетической инженерии является разработка методов по экспериментальному переносу из одной клетки в другую целых хромосом. Метафазные хромосомы, выделенные из клетки-донора, могут внедриться в клетку-реципиент путем пикноцитоза. Хромосомы, внедрившиеся в чужую клетку, рас­падаются на мелкие фрагменты; некоторые из них сохраняют­ся на протяжении нескольких поколений в цитоплазме клетки-реципиента. ДНК, содержащаяся в этих фрагментах, может осу­ществлять синтез полипептидов. Так, например, в клетки мыши (in vitro) была перенесена 17-я хромосома человека, содержа­щая гены, контролирующие синтез тимидинкиназы и галактокц-назы. При размножении в мышиных клетках данные гены до­вольно стойко функционировали. приводит пример использования данного метода в медицине при лечении больных телассемией — тяжелым наследственным заболевани­ем, обусловленным мутацией генов, кодирующих глобиновые белки —

полипептидные цепи α и β, в результате чего образуют­ся дефектные эритроциты. У больного телассемией берут не­большое количество кроветворных клеток костного мозга, раз­множают их в культуре вне организма, затем методами генети­ческой инженерии вводят в них полноценные гены, кодирующие глобин, обеспечивающий нормальное развитие эритроцитов. Та­кие клетки снова вводят в костный мозг того же больного, и они постепенно замещают мутантные патологические эритроциты.

В животноводстве большой интерес представляют методы пересадки клеточных ядер в цитоплазму другого животного — получение цибридов. Например, у мыши извлекали неоплодотворенную яйцеклетку, вводили в нее ядро соматической клетки другого животного и трансплантировали ее в матку самки, гор­монально подготовленной к имплантации. Потомство было ге­нетически тождественно той особи, у которой было взято ядро.

Гибридизация соматических клеток. Одной из проблем гене­тической инженерии является гибридизация соматических кле­ток, Впервые возможность гибридизации клеток, культивируе­мых вне организма, установил в 1960 г. Ж. Барский. В 1965 г. г. Харрис обнаружил, что эффективность гибридизации сомати­ческих клеток резко повышается при обработке их инактивируемым парагриппозным вирусом Сендай. В настоящее время разработаны и успешно применяются методы, позволяющие до­биться слияния клеток различных видов млекопитающих и да­же клеток систематически далеких организмов. Например, клетки человека могут сливаться с клетками мыши, крупного рогатого скота, курицы, комара и даже с клетками растений — моркови, табака.

Когда сливаются клетки относительно близких видов, то гибридная клетка может делиться митотически. В процессе де­ления происходит потеря хромосом одного из видов. Так, в гиб­ридных клетках человек — мышь элиминируются хромосомы человека, что позволяет установить локализацию в них соответ­ствующих генов. Применяя цитогенетический анализ, устанав­ливают, какая из 23 человеческих хромосом содержится в гиб­ридной клетке. С помощью культивирования их на селективных средах определяют, какие гены в данной хромосоме локализо­ваны. Этим методом в настоящее время локализовано порядка 2000 генов в хромосомах человека.

Получение аллофенных животных. Аллофенными называют химерные организмы, содержащие разные ткани, произошед­шие из клеток, полученных от разных родителей. Б. Минтц по­лучил аллофенных мышей путем образования смешанной блас­тулы из клеток черных и белых мышей (рис. 43).

В последую­щих опытах соединяли бластомеры животных, различающихся по другим признакам — окраске радужной оболочки, длине ушей и хвоста и др. Для получения аллофенных потомков у бе­ременных мышей, имеющих четко выраженные альтернативные признаки, извлекали эмбрионы на стадии восьми бластомеров и с помощью фермента проназы отделяли бластомеры.

Комбинируя бластомеры от двух (и более) эмбрионов, создали в спе­циальной питательной среде единый комплексный эмбрион, ко­торый ввели в матку мыши, гормонально подготовленной к имплантации зародыша. Рождавшиеся мышата представляли со­бой мозаиков, у них проявлялись признаки всех родительских форм. Методика, разработанная на мышах, в последние годы используется для получения аллофенных овец.

Контрольные вопросы. 1. Докажите, что ДНК принадлежит ведущая роль в наследственности. 2. Каким образом ДНК осуществляет сохранение, передачу и реализацию наследственной информации? 3. Какую роль выпол­няет каждый фрагмент ДНК, входящий в оперон? 4. Какие свойства прису­щи генетическому коду? 5. Что такое ген в современном понимании? Ка­ковы функции и свойства генов различных типов? 6. Каким образом осу­ществляются синтез и выделение генов? Какие векторы вы знаете? 7. Народ­нохозяйственное значение генетической инженерии.

ГЛАВА 9. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

Процесс индивидуального развития особи — онтогенез — начи­нается с акта оплодотворения и заканчивается смертью. В про­цессе онтогенеза реализуется наследственная информация, при­сущая генотипу данной особи. Она определяет время, место и последовательность развития органов и признаков. Онтогенез запрограммирован в генотипе особи, но осуществляется в кон­кретных условиях внешней среды, определяющей характер и возможности реализации наследственной информации. При изу­чении закономерностей индивидуального развития животного или растения большое внимание уделяется процессу формиро­вания органов — органогенезу. Постепенное становление формы и функции каждого органа у данной особи в процессе ее разви­тия определяет морфогенез.

При изучении онтогенеза главной задачей является рас­крытие закономерностей конкретной реализации гена: каким образом ген, локализованный в молекуле ДНК, контролирует развитие специфического признака, характерного для вида, по­роды и отдельной особи.

У прокариот путь от гена к признаку относительно простой; ген контролирует синтез фермента и его активность регулиру­ется процессами, протекающими непосредственно в клетке. Мы можем судить о генотипе данного штамма бактерии Е. coli по его способности синтезировать фермент, аминокислоту, анти­биотик или другое вещество или гидролизовать питательный субстрат, на котором он размножается. Благодаря механизму регуляции генетического кода бактерии обеспечивают своевре­менную активность генов, синтезирующих ферменты, необходи­мые клетке в данный период ее жизнедеятельности. Следова­тельно, у прокариот четко прослеживается связь между геном и признаком: ген → фермент → признак.

Значительно сложнее этот процесс осуществляется у высших многоклеточных сложноорганизованных особей. Каждый признак у них контролируется, как правило, многими генами, формируется в онтогенезе под влиянием многих ферментов, во взаимодействии с другими органами и тканями. Например, окраска меха у норок контролируется более чем 20 генами, окраска шерсти у крупного рогатого скота зависит от различно­го сочетания 10 генов, цвет глаз у дрозофилы зависит от 20 ге­нов. Каждый ген в генотипе особи представлен двумя аллелями, в результате перекомбинации которых может осуществлять­ся самое разнообразное проявление признака. Важное значение для характера проявления признака имеет и возможное взаимо­действие генов.

Существенное влияние на характер развития органа и про­явления признака могут оказывать условия внешней среды. У животных эмбриональное развитие протекает в организме матери, поэтому на признаки, формирующиеся до рождения, внешняя среда оказывает относительно слабое влияние, опо­средованно через организм матери. Они развиваются главным образом под контролем генотипов родительских форм, и после рождения почти не изменяются. К таким признакам в первую очередь относят морфологические особенности строения каждо­го органа, а также группы крови, типы гемоглобина и др.

В постэмбриональный период условия внешней среды ока­зывают существенное влияние на характер проявления главным образом количественных признаков, определяющих продуктив­ность животного. Очень показательны в этом отношении одно­яйцовые близнецы. Идентичность их генотипов четко проявляет­ся в распределении окраски шерсти, форме рогов, строении ко­нечностей, но форма тела, масса, продуктивность значительно изменяются под влиянием скудного или, наоборот, обильного кормления

Биогенетический закон онтогенеза. Онтогенез имеет генети­ческую предопределенность развития животных данного клас­са и свидетельствует об общности их происхождения. Общность происхождения генетически разных форм отражена в чертах их развития и порядке смены этапов и фаз, в появлении у си­стематически разных групп ряда черт, характерных для их предковых форм.

Онтогенез каждой особи подчиняется биогенетическому за­кону Мюллера-Геккеля: сходство эмбриональных черт разви­тия отражает степень родства разных форм в силу общности их происхождения. Процесс дробления зиготы у всех многокле­точных животных организмов проходит начальные стадии эм­бриогенеза — бластулу и гаструлу. Для позвоночных характер­но прохождение стадии, на которой у наземных форм, дыша­щих легкими, образуются жаберные дуги, как и у рыб.

В филогенетических рядах характерен параллелизм гисто­логической структуры и функций некоторых тканей — нервной, мышечной, эпителиальной, соединительной. Наличие этой зако­номерности, установленной русским ученым (1886—1945), отражает общность генетической детерминации клеток в весьма давно и далеко разошедшихся классах, на­пример у млекопитающих и у насекомых.

Вместе с тем необходимо учитывать и различия в онтогене­зе у разных форм, которые накладываются на общий характер развития, что свидетельствует о специфике генетической инфор­мации. Так, например, в яйцах рыб и птиц содержатся большие запасы желтка, что сказывается на их эмбриогенезе.

Неравномерность и неодновременность процессов роста и дифференцировки. Рост может осуществляться либо за счет де­ления клеток, либо за счет их растяжения. В период роста ор­ганов и тканей преобладают процессы, обеспечивающие митотическую активность клеток. В этот период наиболее активно функционируют гены, контролирующие синтез ферментов, обес­печивающих все периоды и фазы митотического цикла.

В эмбриональной ткани животных клетки относительно оди­наковы по форме и составу белков. Позже они дифференцируют­ся, при этом эмбриональная клетка превращается в клетку с различной специализацией. Такое проявление различий между клетками называют дифференцировкой, а клетки — дифференци­рованными. В период дифференцировки активно функциониру­ют гены, контролирующие синтез специфических белков, необ­ходимых для формообразовательных процессов и интеграции специализированных клеток.

Необратимость и обратимость процесса дифференцировки соматических клеток и тканей. Зигота содержит полный набор генов и всю генетическую информацию данного вида, породы и особи; она тотипотентна (омнипотентна), то есть обладает всеми возможностями развития и формирования органов и при­знаков взрослой особи. Дифференцировка клеток не приводит к потере ими имеющихся возможностей. Генетическая информа­ция, содержащаяся в молекулах ДНК, одинакова в любой со­матической клетке, то есть каждая соматическая клетка потен­циально способна дать начало новому организму. Тотипотентность соматических клеток характерна для растений. Из оди­ночных клеток, выделенных из дифференцированных тканей любого органа, можно в пробирочной культуре получить целое растение, идентичное исходному. Такие растения получают из корнеплодов сахарной свеклы и моркови, из клетки листа бего­нии и многих других культур. У животных тотипотентность кле­ток сохраняется только на ранних этапах онтогенеза. Р. Бриггс и Т. Кинг (1952), Дж. Гёрдон (1964) выделяли ядра из мы­шечных клеток или из клеток кишечного эпителия головастиков шпорцевой лягушки и пересаживали их в безъядерные активи­рованные яйцеклетки. Из некоторых яйцеклеток с пересажен­ным ядром соматической клетки развивались нормальные голо­вастики и взрослые особи (рис. 44).