Клинико-морфологические особенности различных молекулярно-генетических типов рака молочной железы (стр. 2 )

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 4 журнальных статьи в рекомендованных ВАК изданиях, 10 тезисных работ в материалах региональных, всероссийских и международных съездов и конференций, 1 статья в зарубежном издательстве.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, главы о материалах и методах исследования, результатах собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками. Список литературы содержит 247 источника, из них 52 отечественных и 195 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования

В исследование были включены 163 больных инвазивным раком молочной железы T1-4N0-3M0 в возрасте от 21 до 80 лет, находящихся на лечении в отделении общей онкологии ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН с 1999 по 2007 г. Предоперационного лечения больные не получали.%) больным была проведена радикальная мастэктомия,%) – секторальная резекция молочной железы с аксиллярной лимфаденэктомией. В послеоперационном периоде 122 больным проводилась адъювантная химиотерапия по схемам CMF, FAC, CAХ. 41 больной в постменопаузе назначалась антиэстрогенная терапия тамоксифеном. 40 больным в послеоперационном периоде дополнительно выполнялась дистанционная гамма-терапия в стандартном режиме на послеоперационный рубец и/или зоны регионарного лимфооттока. Сроки наблюдения за больными составили от 5 до 10 лет. Анализировались первичные документы – истории болезни и амбулаторные карты больных.

Средний возраст больных составил 55,9±11,1 лет. Большую часть представляли пациентки старше 50 лет – их было %). Меньшими по количеству оказались группы больных в возрасте от 35 до 50 лет -%) и до 35 лет – 3 (2%). У 53 больных менструальная функция была сохранена (средний возраст 43,6±6,9), у 110 определялась менопауза (61,8±7,3). Распространенность заболевания определялась согласно международной классификации по системе TNM (2003 г.). Чаще выявлялись I (у%) пациенток ), IIА (в%) случаях и IIБ (у%) больных) стадии заболевания. IIIА, IIIВ и IIIC стадии диагностировались реже.

Морфологическому исследованию подвергался операционный материал.

Методы исследования

Выполнялось морфологическое изучение операционного материала. Макроскопической оценке подвергалась ткань первичной опухоли, ткань молочной железы вне новообразования (для определения возможного скрытого мультицентрического роста) и все удаленные лимфоузлы.

Материал фиксировался в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводка материала и изготовление гистологических препаратов осуществлялось по стандартной методике. Препараты окрашивались гематоксилином и эозином. Исследование выполнялось с применением светового микроскопа «Carl Zeiss Axio Lab.A1» (Германия).

Для морфологического исследования ткани первичной опухоли был разработан следующий алгоритм оценки:

1. Определение гистологического типа рака.

2. Оценка степени злокачественности новообразования.

3. Определение соотношения паренхиматозного и стромального компонентов опухоли.

4. Характеристика паренхиматозного компонента:

а) характеристика протокового компонента;

б) характеристика инфильтративного компонента:

- определение типа структур инфильтративного компонента;

- подсчет количества разных типов структур.

5. Характеристика стромального компонента:

а) оценка выраженности гиалиноза стромы опухоли;

б) оценка выраженности воспалительной инфильтрации стромы.

6. Исследование рецепторного статуса новообразования.

7. Оценка HER2/neu статуса опухоли.

8. Определение пролиферативной активности.

9. Изучение биологических свойств опухолевых клеток:

а) характеристика параметров апоптоза;

б) характеристика межклеточной адгезии в опухоли;

в) определение экспрессии трансформирующего фактора роста β и его рецептора.

Гистологический тип рака устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ, Женева, 2012. В исследование включались только случаи с инвазивной карциномой неспецифического типа. Степень злокачественности оценивалась по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. При этом учитывалось количество тубулярных структур, число митозов и клеточный полиморфизм. Соотношение паренхиматозного и стромального компонентов новообразования оценивалось по трех балльной системе. Одним баллом оценивали случаи, когда доля паренхиматозного компонента превышала 70%, двумя баллами (умеренно выраженный фиброз) - когда доля паренхиматозного компонента составляла 10-70%, тремя баллами (резко выражен) – когда доля паренхиматозного компонента составляла менее 10%. В инфильтративном компоненте выделялись альвеолярные, трабекулярные, тубулярные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток. Альвеолярные структуры представляли собой скопления опухолевых клеток либо округлой, либо слега неправильной, напоминающей округлую, формы. Морфологическое строение клеток, образующих данный вид структур, варьировало от мелких с умеренно выраженной цитоплазмой и округлыми ядрами, до крупных с гиперхромными, неправильной формы ядрами и умеренной цитоплазмой. Трабекулярные структуры были либо короткими, образованными одним рядом мелких достаточно мономорфных клеток, либо широкими, состоящими из 2-3 рядов клеток средних размеров с умеренно выраженной цитоплазмой, с округлыми нормохромными или гиперхромными ядрами. Тубулярные структуры были образованы одним рядом достаточно мономорфных клеток с нормохромными округлыми ядрами. Солидные структуры были различными по размеру и форме и состояли либо из мелких клеток с умеренно выраженной цитоплазмой и мономорфными ядрами или из крупных клеток с обильной цитоплазмой и полиморфными ядрами. Группы клеток представляли собой либо отдельные опухолевые клетки, либо скопления из 1-4 клеток вариабельных по своему морфологическому строению. Чаще всего, инфильтративный компонент имел смешанное строение. В каждом случае указывалось количество разных типов структур в инфильтративном компоненте. Минимально в опухоли мог определяться только один какой-либо тип структур, максимально – все пять выделяемых типов. Стромальный компонент опухоли характеризовался по выраженности гиалиноза и воспалительной инфильтрации. Выраженность гиалиноза и воспалительной инфильтрации стромы также оценивались по трех балльной системе (1 балл - слабо, 2 балла - умеренно, 3 балла - резко выражен).

Определение рецепторного, HER2/neu статуса, пролиферативной активности (экспрессия Ki67) и таких биологических свойств опухолевой ткани, как параметры апоптоза (экспрессия р53, bcl2), межклеточной адгезии (экспрессия Е-кадхерина, α-катенина), экспрессии трансформирующего фактора роста β и его рецептора выполнялось с использованием иммуногистохимического метода исследования. Иммуногистохимическое исследование осуществлялось по стандартной методике. Применялись антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину c – erbB – 2 (HER2/neu статус) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные), фирмы «Novocastra» к р53 (клон CM1, рабочее разведение 1:150), к bcl2 (клон bcl2/100/D5, рабочее разведение 1:80), к Е - кадхерину (клон 36B5, рабочее разведение 1:30), к TGFβ (клон TGFβ17, рабочее разведение 1:40), к TDGβR1 (клон 8А11, рабочее разведение 1:50), фирмы «Diagnostic Biosistem» к α-катенину (поликлональные, рабочее разведение 1:50). Оценка экспрессии рецепторов к половым гормонам проводилась количественным методом гисто-счета (Histo-Score). При этом подсчитывался процент позитивных клеток и показатель экспрессии в баллах (, 2012). HER2/neu негативными считались случаи с отсутствием окрашивания или слабым прерывистым мембранным окрашиванием. К HER2/neu позитивным относили случаи с интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток. Случаи с умеренным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток или интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием менее чем в 10% клеток, требующие выявления наличия амплификации гена HER2/neu методом FISH или CICH/SISH, не включались в исследование. Экспрессия рецепторов к р53, к Ki67, к bcl2, к TGFβ, к TGFβR, Е - кадхерину, α-катенину оценивалась в процентом содержании положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли инвазивной карциномы неспецифического типапа (в 10 полях зрения на 1000 клеток при увеличении х400).

На основании сочетания экспрессии рецепторов к эстрогенам, прогестерону, HER2/neu статуса и Ki67 определялись 4 основных молекулярно-генетических типа: люминальный А (позитивная экспрессия рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki67 <20%), люминальный В (позитивная экспрессия рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki67 ≥20%), трипл-негативный (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, негативный HER2/neu статус), тип с гиперэкспрессией HER2/neu (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, позитивный HER2/neu статус). Группу люминального А типа рака молочной железы составила 101 пациентка, группу люминального В типа - 23 больных, группу трижды негативного рака - 25 пациенток и с гиперэкспрессией HER2/neu – 14 женщин (рис. 1).

В лимфатических узлах оценивалось наличие метастатического поражения, подсчитывалось количество лимфоузлов с метастазами. Сведения о частоте и сроках гематогенного метастазирования получали при анализе историй болезни или амбулаторных карт пациенток.

Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 6.0 for Windows». Применялся дисперсионный анализ, критерий х2, метод логистической регрессии. Обсуждались результаты с достоверностью различий при р < 0,05 и с тенденцией различий при р < 0,1.

Рис. 1. Распределение больных, включенных в исследование, на группы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основные клинические параметры больных с разными молекулярно-генетическими типами рака молочной железы

В исследовании анализировались различные клинические параметры, характеризующие как организм в целом (возраст, состояние менструальной функции пациенток), так и опухоль в частности.

Средний возраст больных с разными молекулярно-генетическими типами рака молочной железы не различался и составлял при люминальном типе А 55,9±10,5 лет, при люминальном В 53,4±12,1 года, при трижды негативном 59,1±11,7 лет и при типе с гиперэкспрессией HER2/neu 53,7±12,3 года. Во всех изучаемых группах у пациенток чаще регистрировалось состояние менопаузы, по сравнению с больными, у которых менструальная функция была сохранена (соответственно: люминальный А - 66% и 34%, р=0,0000; люминальный В - 65% и 35%, р=0,02; трижды негативный – 76% и 24%, р=0,0003; с гиперэкспрессией HER2/neu – 64% и 36%, р=0,07).

В большинстве наблюдений выявлялось одностороннее поражение молочной железы. Частота встречаемости билатеральных опухолей достоверно не различалась и соответствовала 5% при люминальном А, 9% при люминальном В, 4% при трижды негативном типе и 14% при раке с гиперэкспрессией HER2/neu. При всех изучаемых молекулярно-генетических типах чаще опухоли локализовались в наружных квадрантах (соответственно: люминальный А – 54%, люминальный В – 71%, трижды негативный – 63%, с гиперэкспрессией HER2/neu – 60%). Частота выявления мультицентрического характера роста опухоли также не различалась в исследуемых группах пациенток (соответственно: люминальный А – 21%, люминальный В – 22%, трижды негативный – 13%, с гиперэкспрессией HER2/neu – 21%).

Опухоли небольших размеров, не превышающих 2 см в диаметре (T1), чаще присутствовали в группах пациенток с люминальными типами рака, в то время как более крупные новообразования были характерными для больных с трижды негативными опухолями и с типом, характеризующимися гиперэкспрессией HER2/neu (рис. 2).

Рис. 2. Размер опухоли у больных с разными молекулярно-генетическими типами рака молочной железы.

Рак молочной железы I стадии в основном встречался при люминальном А (33%) и люминальном В (22%) раке молочной железы, по сравнению с трижды негативными новообразованиями (4%; р=0,002; р=0,03) и с опухолями, характеризующимся гиперэкспрессией HER2/neu (0%; р=0,006; р=0,03). Полученные результаты несколько отличаются от общеизвестных, согласно которым люминальные В опухоли имеют крупные размеры (Cheang M.C.U., 2009). IIIB стадия чаще диагностировалась у пациенток с опухолями, характеризующимся гиперэкспрессией HER2/neu в 21% наблюдений, тогда как при люминальном А и В раках в 4% (р=0,007 и р=0,05 соответственно). При трижды негативных опухолях чаще (68%) обнаруживалась IIA стадия процесса, в сравнении с люминальными А и В раками (р=0,002 и р=0,04, соответственно).

Особенности морфологического строения первичной опухоли при разных молекулярно-генетических типах рака молочной железы

У всех больных, включенных в исследование, гистологический тип новообразования соответствовал инвазивной карциноме неспецифического типа (инвазивному протоковому раку по прежней классификации). При морфологическом исследовании первичной опухоли в подавляющем большинстве наблюдений была выявлена вторая степень злокачественности: в 90% случаев при люминальном А, в 80% случаев при люминальном В, в 95% случаев при трижды негативном и в 86% случаев в группе новообразований с гиперэкспрессией HER2/neu. Частота обнаружения протоковых структур не различалась в исследуемых группах.

Исследование инфильтративного компонента первичного опухолевого узла позволило выявить ряд признаков, более характерных для того или иного молекулярно-генетического типа рака молочной железы. Оказалось, что инфильтративный компонент при люминальном А и В молекулярно-генетических типах оказался максимально разнообразным, в нем чаще (в 13% и 22% случаев) обнаруживались все пять, выделяемых нами, типов структур (альвеолярные, трабекулярные, тубулярные, солидные и дискретно расположенные группы опухолевых клеток). В то время как, при ТНР и в опухолях, характеризующихся гиперэкспрессией HER2/neu, чаще (в 16% и 14% случаев) выявлялись мономорфные по своему гистологическому строению новообразования, в инфильтративном компоненте которых присутствовал всего лишь один из вариантов структур. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной внутриопухолевой морфологической гетерогенности в группах больных с люминальными новообразованиями (табл. 1).

Талица 1

Количество разных типов структур в инфильтративном компоненте инвазивной карциномы неспецифического типа в зависимости от молекулярно-генетического варианта новообразования

Количество типов структур в инфильтративном компоненте	Молекулярно-генетический тип абс. ч., (%)
люминаль-ный А (n=101)	люминаль-ный В (n=23)	трижды негатив- ный (n=25)	с гипер-экспрессией HER2/neu (n=14)
Один	4/101 (4%)	1/23 (4%)	4/25 (16%) р1=0,01 р2=0,08	2/14 (14%) р1=0,05
Два	17/%)	4/23 (17%)	6/25 (24%)	4/14 (29%)
Три	45/101 (44%)	8/23 (35%)	8/25 (32%)	5/14 (36%)
Четыре	22/101 (22%)	5/23 (22%)	6/25 (24%)	3/14 (21%)
Пять	13/101 (13%) р4=0,07	5/23 (22%) р3=0,03 р4=0,03	1/25 (4%)	0/14 (0%)

Изучение присутствия в инфильтративном компоненте определенного варианта структур при различных молекулярно-генетических типах показало, что альвеолярные, трабекулярные, солидные структуры и дискретно расположенные группы опухолевых клеток встречаются с приблизительно одинаковой частотой в исследуемых группах (табл. 2). Иная картина обнаруживалась в отношении наиболее дифференцированных, тубулярных структур. В группах больных с трижды негативными опухолями и с раком, характеризующимся гиперэкспрессией HER2/neu, они наблюдались гораздо реже (в 16% и 21% наблюдений в сравнении с люминальными А (45%; р=0,004 и р=0,004 соответственно) и люминальными В (52%; р=0,005 и р=0,03 соответственно) типами новообразований. Полученные результаты косвенно указывают на низкую дифференцировку трижды негативных и HER2/neu позитивных опухолей и не противоречат обсуждаемым в литературе сведениям о низкой степени дифференцировки трижды негативных раков (Toft D.J., 2011).