Биуретовая реакция на белок в диализируемой жидкости. К 5 каплям раствора из мешочка прибавить 3 капли 10% раствора NaOH и 1 каплю 1% раствора CuSO4, перемешать.
Результат: ___________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Биуретовая реакция на белок в диализате. К 5 каплям диализата прибавить 3 капли 10% раствора NaOH и 1 каплю 1% раствора CuSO4, перемешать.
Результат: ___________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Реакция на хлорид в диализате. К 10 каплям диализата прибавить 1 каплю 10 % раствора HNO3 и 1 % раствора AgNO3.
Результат: ___________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Лабораторная работа № 5
Разделение белков и определение их молекулярной массы методом гель – хроматографии
Принцип метода. Разделительный гель состоит из гранул с определенным размером пор и межгранульного пространства. Молекулы, размер которых превышает размер пор гранул, движутся только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание (элюирование) из колонки замедляется. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем больший объем элюирующей жидкости требуется для вымывания его из колонки.
При гель-хроматографии измеряют объем элюирования для каждого вида молекул. Чем больше объем элюирования, тем меньше молекулярная масса молекул. Молекулярную массу исследуемого вещества можно определить с помощью калибровочного графика.
Реактивы:
1) 0,9 % раствор NaCI;
2) гель сефадекса (G-200 или G-100);
3) раствор ненасыщенного голубого декстрана;
4) раствор насыщенного раствора рибофлавина;
5) 20 % раствор гемоглобина;
6) 10 % раствор NaOH;
7) 1 % раствор CuSO4;
8) 0,5 % раствор нингидрина.
Ход работы: Колонку для разделения веществ заполняют гелем сефадекса (G-200 или G-100), полученным при гидратировании сефадекса G-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Слой NaCI всегда должен находиться над гелем, чтобы он не высыхал. На поверхность геля наносят 2—3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ: ненасыщенного раствора голубого декстрана (ММ 107), насыщенного раствора рибофлавина (ММ 3-102) и 200 г/л гемоглобина (ММ 64,6-103). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем. Затем в колонку дважды вносят по 2 мл 0,9 % раствор NaCI. После этого подключают капельницу с 0,9 % раствором NaCI, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т. е. открыт зажим снизу. По мере прохождения через колонку элюирующего раствора смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собирают в отдельную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), а затем гемоглобин (красный) и рибофлавин (желтый). После элюирования смеси колонку промывают изотоническим раствором хлористого натрия до тех пор, пока гель не станет бесцветным, затем закрывают и оставляют небольшой слой раствора над гелем. Только после этого колонку можно использовать повторно.
Для выявления белка с содержимым каждой пробирки проводим биуретовую реакцию: добавляем по 6 капель NaOH и по 2 капли CuSO4. Наблюдают за появлением окраски.
Белки и аминокислоты можно выявить и с помощью нингидриновой реакции.
Для этого в каждую фракцию (пробирку) добавляют по 1 мл нингидринового реактива и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 2 минуты. Во фракциях, содержащих белки или аминокислоты, появляется сине-фиолетовое окрашивание.
Результат:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
III. ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ
Лабораторная работа № 6
Свойства ферментов
Влияние температуры на активность ферментов
Принцип метода. Ферменты (энзимы) – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. Свойство ферментов разрушаться при кипячении является характерной особенностью, отличающей ферменты от других катализаторов. Ферменты термолабильны и проявляют оптимальную активность при температуре 35-45˚С. При повышении температуры свыше 50˚С их активность снижается, а затем происходит разрушение структуры молекулы фермента.
Реактивы:
1. слюна 1:10;
2. 1 % раствор крахмала;
3. раствор Люголя.
Ход работы. В 4 пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Пометают пробирки в разные температурные условия;
1 пробирка - в лед (0°С);
2 пробирка - оставляют при комнатной температуре (20°С);
3 пробирка - и термостат при 37°С;
4 пробирка - в кипящую водяную баню (100°С).
Через 5 минут во все пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала и оставляют их на 10 минут для инкубации в тех же условиях. После инкубации результат действия амилазы на крахмал оценивается с помощью качественной реакции крахмала с йодом: в присутствии крахмала развивается синяя окраска, а при его отсутствии синей окраски не появляется, а остается желтая окраска йода. Таким образом, после инкубация все пробирки охлаждают под краном и добавляют по 2 капли раствора Люголя (содержит йод). Отмечают окраску содержимого пробирок.
Результат:
1 пробирка:_____________________________________________
2 пробирка:_____________________________________________
3 пробирка:_____________________________________________
4 пробирка:_____________________________________________
Вывод: _____________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Влияние рН среды на активность ферментов
Принцип метода. Для амилазы слюны оптимальное значение рН среды 6,8. В кислой и щелочной среде активность амилазы снижается, и расщепление крахмала идет до стадии декстринов, которые с раствором Люголя дают красно-фиолетовую или красно-бурую окраску.
Реактивы:
1. Слюна, раствор 1:10;
2. 1 % раствор крахмала;
3. 1 % Na2HPO4;
4. 1 % NaH2PO4;
5. раствор Люголя.
Ход работы. В 3 пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Затем создают среду с различным рН:
пробирка №1 - добавляют 1 мл дистиллированной воды (нейтральная среда);
пробирка №2 - добавляют 1 мл Na2HPO4 (щелочная среда);
пробирка №3 - добавляю 1 мл NaH2PO4 (кислая среда).
После этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала. Зятем все пробирки помешают в термостат (37°С) на 10 минут. После инкубации пробирки охлаждают. Содержимое второй пробирки нейтрализуют добавлением 2 мл NaH2PO4, так как крахмал в щелочной среде не дает окраска с йодом. Результат оценивается, затем добавить во все пробирки добавляют по 2 капли раствора Люголя. Отмечают окраску содержимого пробирок.
Результат:
Пробирка № 1_____________________________________________________
Пробирка № 2_____________________________________________________
Пробирка № 3_____________________________________________________
Пробирка № 4_____________________________________________________
Вывод: ______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Специфичность действия амилазы и сахаразы
Принцип метода. Специфичностью называется способность ферментов ускорять отдельные химические реакции только между строго определенными веществами. Результат действия ферментов амилазы и сахаразы на субстраты крахмал и сахарозу оценивается с помощью качественной реакции Фелинга. Крахмал и сахароза не имеют свободных полуацетальных гидроксилов и поэтому не восстанавливают Cu+2 сульфата меди (реактив Фелинга I), которые придают раствору голубую окраску, до Сu2О (осадок кирпично-красного цвета), то есть дают отрицательную реакцию Фелинга, а продукты расщепления крахмала и сахарозы (мальтоза и глюкоза) имеют свободные полуацетальные гидроксилы и дают положительную реакцию Фелинга.
Реактивы:
1. 1 % раствор крахмала;
2. 2 % раствор сахарозы;
3. слюна 1:10;
4. сахараза из дрожжей;
5. 10 % NaOH;
6. раствор Люголя.
Ход работы.
Берут 4 пробирки и вносят реактивы по следующей схеме.
1 пробирка - 2 мл сахарозы и 0.5 мл разведенной слюны;
2 пробирка - 2 мл сахарозы и 0.5 мл сахаразы;
3 пробирка - 2 мл крахмала и 0.5 мл разведенного слюны;
4 пробирка - 2 мл крахмала и 0.5 мл сахаразы.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 |
