Содержимое пробирок хорошо перемешивают и ставят на 10 минут в термостат (37°С). После инкубации во все пробирки добавляют по 5 капель реактива Фелинга I, по 5 капель реактива Фелинга II и ставят в кипящую баню на 2 минуты. Отмечают изменения окраски.

Результат:

Пробирка № 1_____________________________________________________

Пробирка № 2_____________________________________________________

Пробирка № 3_____________________________________________________

Пробирка № 4_____________________________________________________

Вывод: _____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 6

Регуляция активности ферментов

Изучение аллостерических свойств а-амилазы

Принцип метода. Некоторые лекарственные препараты и хлориды металлов могут оказывать аллостерическое влияние на активность амилазы. Активность амилаза определяется фотометрически по уменьшению количества крахмала в ходе его гидролиза под действием амилазы. Крахмал выявляется в цветной реакции с йодом. Для создания среды, оптимальной для работы фермента, используется фосфатный буфер рН 7,2.

Ход работы.

1). Приготовление раствора амилазы. Собирают в пробирку 0.5 мл не разведенной слюны, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой и тщательно перемешивают содержимое пробирки.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

2). Приготовление раствора лекарственного препарата. Таблетку растирают в ступке, порошок растворяют в буфере и количественно переносят в мерную колбу объемом 100 мл, объем жидкости доводят до метки буфером.

3). Инкубация амилазы с лекарственным препаратом: берут 2 стаканчика и смешивают растворы:

1 стаканчик - 1 мл амилазы в 1 мл буфера;

2 стаканчик - 1 мл амилазы и 1 мл раствора лекарственного препарата.

Инкубируют 15 минут при 37°С (термостат).

4). Определение активности амилазы. Берут 3 пробирки и вносят следующие растворы:

1 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №1;

2 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №2;

3 пробирка - 0,05 мл буфера.

Во все пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала, хорошо перемешивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. После инкубации в каждую пробирку вносят 1 мл раствора йода и 8 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивают и немедленно измеряют светопоглощение против дистиллированной воды на фотоэлектроколориметре, светофильтр №8, кювета с толщиной слоя 1 см. Записывают величину экстинкции для каждой пробирки (Е1,Е2,Е3).

5). Расчет активности амилазы. Активность амилазы выражают в граммах крахмала, расщепленного 1 литром слюны за 1 час инкубации при 37°С. активность амилазы без лекарственного вещества – А1:

А1=(Е3-Е1)/Е3*80 г/(л*час)

Активность амилазы в присутствии лекарственного вещества - А2:

А2=(Е3-Е2)/Е3*80 г/(л*час)

Сравнивая величины А1 и А3, можно сделать вывод о наличии аллостерических влияний на активность амилазы и их направленности.

Результат: ___________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Е1=_________________________

Е2=_________________________

Е3=_________________________

А1=_________________________

А2=_________________________

Вывод_______________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 7

Количественное определение активности фермента

Действие амилазы на крахмал

Принцип метода. Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала (гликогена) через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, а затем глюкозы.

(С6Н10О5)n→(С6Н10О5)х→y С12Н22О11→n С6Н12О6

Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску или вообще не окрашиваются.

Поэтому, если к раствору крахмала прибавить раствор слюны и через определенные промежутки времени добавлять в пробы 1% раствор йода, то жидкость сначала приобретает синий цвет, а затем — фиолетовый, красный, оранжевый и желтый. Это объясняется тем, что амилаза слюны расщепляет крахмал, образуя ряд промежуточных продуктов. Амилодекстрины и эритродекстрины дают с йодом гамму цветов—от фиолетового до оранжевого. Мальтодекстрины и мальтоза окрашивания с йодом не дают.

Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — могут быть обнаружены реакцией Троммера

Ход работы. Сначала готовят раствор амилазы. Для этого собирают небольшое количество слюды (примерно 0,5 мл) и разводят ее дистиллированной, водой. Разведенную слюну используют в качестве источника амилазы. Далее берут 7 пробирок.

В каждую пробирку наливают из бюретки по 1 мл раствора крахмала и добавляют по 1 мл раствора слюны. Затем в пробирки с интервалами по 5 минут добавляют по 1-2 капле раствора Люголя (содержит йод). Пробирки встряхивают, отмечают цвет раствора.

Результат:

№ пробирки

Время инкубации (мин)

Окраска

1

0

2

5

3

10

4

15

5

20

6

25

7

30

Вывод: ______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

IV. ТЕМА НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Лабораторная работа № 8

Кислотный гидролиз нуклеопротеинов.

Принцип метода. Нуклеопротеиды – сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты. В кислой среде происходит ослабление ионного взаимодействия между белком и нуклеиновыми кислотами и их разделение. При последующем нагревании гидролиз протекает до аминокислот, пуриновых или пиримидиновых оснований, рибозы или дезоксирибозы, фосфорной кислоты.

Реактивы:

1.  пекарские дрожжи;

2.  10% раствор H2SO4;

3.  10% раствор NaOH;

4.  1% раствор CuSO4;

5.  аммиак концентрированный;

6.  1% раствор нитрата серебра;

7.  1% спиртовой раствор тимола (или нафтола);

8.  концентрированная H2SO4;

9.  30% раствор NaOH;

10.  7% раствор СuSO4;

11.  молибденовый реактив;

12.  1% раствор дифениламина.

Ход работы: 1 г пекарских дрожжей помещают в круглодонную колбу. Добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты, 20 мл воды и закрывают пробкой с обратным холодильником. Кипятят 40-50 мин. Охлаждают, переливают в цилиндр. Доводят до первоначального объема и фильтруют.

С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов:

Проба на пептиды: 5 капель гидролизата смешивают с 10 каплями 10% раствора NaOH и 1 каплей 1 % раствора CuSO4. Содержимое окрашивается в розовый цвет.

Проба на пуриновые основания: к 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного аммиака и 5 капель 1 % раствора нитрата серебра. Через 3-5 амин появляется бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.

Проба на пентозы (реакция Молиша): к 10 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли 1% спиртового раствора тимола (или нафтола). Содержимое перемешивают и по стенке приливают 20 капель концентрированной серной кислоты.

При встряхивании образуется красное окрашивание продукта конденсации фурфурола с тимолом, образовавшимся из пентозы.

Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу: к 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30% раствора NaOH и 1-3 капли 7% раствора СuSO4 до появления неисчезающей мути Cu(OH)2 перемешивают. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) или красный осадок оксида меди (I).

Качественная реакция на рибозу и дезоксирибозу с дифениламином: дифениламин дает синее окрашивание с дезоксирибозой и зеленое - с рибозой. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1% раствора дифениламина и пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Развивается сине-зеленое окрашивание.

Проба на фосфорную кислоту: к 3-5 каплям гидролизата прибавляют 20 капель молибденового реактива (7,5 г молибдена аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты с относительной плотностью 1,2) и кипятят несколько минут. Развивается желтое окрашивание. Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.

Результат: ___________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод_______________________________________________________________________

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13