Лекции по биологической и медицинской физике (стр. 1 )

Факультет Фундаментальной Медицины МГУ

Лекции по биологической и медицинской физике Работа и энергия Биологические мембраны. Строение Фазовые переходы липидов в мембранах Диффузия как результат "случайных блужданий" частиц Диффузия ионов при наличии электрического поля Кинетика реакций цепного окисления липидов Cвечение сопровождающее биохимические реакции Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях Метод электронного парамагнитного резонанса Кинетика химических реакций Кальциевый насос животной клетки Реакции окисления - восстановления

Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция

РЕЗЮМЕ

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что стало главным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. В присутствии определенных соединений, активаторов ХЛ, хемилюминесценция при реакциях активных форм кислорода и пероксидации липидов может быть усилена в тысячи и сотни тысяч раз.

В основе биолюминесценции лежат химические превращения особых веществ (люциферинов) под действием специальных ферментов (люцифераз). Как хемилюминесценция, так и биолюминесценция находят широкое применение в аналитической биохимии, в частности, в клиническом биохимическом анализе.

Активированная хемилюминесценция

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не случайно получила название "сверхслабого свечения" [1] . Это оказалось главным и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию собственной хемилюминесценции в аналитических целях.

Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной литературе общее название "активаторов", а за рубежом - "усилителей" (enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать химическими и физическими активаторами [2].

Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.

Наблюдаемое при этом hemilum связано с переходом молекул в основное состояние., что приводит к высвечиванию фотонов:

Активатор + радикалы → продукт* → продукт + фотон

Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид, см. Рис. 4) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)]. На рис. 1 дана упрощенная схема превращений люминола в присутствии радикалов кислорода. Под действием окислителя, в нашем случае - радикала гидроксила, происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалов, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света.

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся hemilumм, но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы → продукт* → продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор → продукт + активатор* → фотон 2 (активированная ХЛ)

Интенсивность свечения в большой степени зависит от квантового выхода люминесценции продукта реакции, т. е. от того, какая часть возбужденных молекул продукта перейдет в основное, невозбужденное состояние с испусканием фотона. Обычно эта доля невелика, всего десятые или даже сотые доли процента. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения на молекулам активатора, то интенсивность свечения будет теперь определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице.

К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов. Измерение этой хемилюминесценции пока еще не стало рутинным лабораторным методом в значительной мере из-за ее низкой интенсивности. Поэтому ведется поиск веществ, усиливающих “липидную” ХЛ. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесценции.

Так например, комплекс редкоземельного иона европия (Eu3+) c антибиотиком хлор-тетрациклином усиливает ХЛ при окислении липидов почти в 1000 раз. Один из красителей, производное кумарина, применяемое при создании лазеров под условным названием С-525, усиливает хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более, чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на ХЛ при взаимодействии радикалов кислорода (гидроксила и супероксида). Формула этого вещества приведена ниже.

Активируют hemilum (правда в меньшей степени) и такие известные красители как родамин Ж6, нильский красный и нильский синий, а также некоторые порфирины. Все эти активаторы не оказывают влияния на ход реакций перекисного окисления, но заметно увеличивают интенсивность свечения. По-видимому, в основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции (например, кетона)на активатор:

LOO· + LOO· → LOH + L=O* + O2 L=O* → L=O + hn 1 (слабое hemilum; j = 10-4) L=O* + А → L=O + А* (перенос энергии) А* → А + hn A (яркое hemilum; j = 10-2 - 10-1)

Интенсивность свечения в присутствии активатора во много раз выше, чем без него, по той причине, что квантовый выход j люминесценции активатора (А) выше квантового выхода люминесценции продукта реакции (Р). Было также показано, что спектр активированной хемилюминесценции в изученных случаях был сходен со спектром фотолюминесценции активатора, т. е. его люминесценции при освещении ультрафиолетовыми лучами.

Использование активированной ХЛ в биохимических анализах

Обнаружение катализаторов, разлагающих перекись водорода с образованием свободных радикалов

Чистая перекись водорода с люминолом реагирует вяло, и хемилюминесценция при этом не наблюдается. Если перекись водорода разлагается ферментативным путем, например, при действии каталазы, свободные радикалы не образуются и hemilum также не возникает. В присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как железо, медь или марганец, а также некоторых их комплексов, например, производных гема, перекись водорода разлагается с образованием радикалов (гидроксила и супероксида) и возникает яркое hemilum, связанное с реакциями люминола (см. Рис. 1).

Рис. 1. Химические превращения люминола под действием активных форм кислорода - радикалов гидроксила и супероксида. Продукт реакций 3-аминофталат образуется в электронно-возбужденном состоянии и переходит в основное состояние с испусканием кванта света.

По этой причине хемилюминесценция в присутствии люминола часто используется для определения в биологических средах малых количеств геминовых соединений, металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода.

Приведем некоторые примеры.

У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться очень небольшие количества миоглобина. Гем-содержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают очень яркое hemilum в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. hemilum мочи в этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного (Барон, 1985 , цит. По [1]).

На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза - фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гем-содержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси.

Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньшее. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур [4].

Люминесценция фагоцитов

В рассмотренных случаях радикалы кислорода образовывались при разложении перекиси водорода, добавленной экспериментатором. Но живые клетки - фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги) сами образуют активные формы кислорода при их стимулировании. При этом наблюдается хемилюминесценция, особенно яркая в присутствии люминола (или люцигенина).

Рис. 2. Хемилюминесценция клеток крови после их стимуляции электрическими импульсами. А - кривые хемилюминесценции в присутствии люминола после действия на кровь электрических импульсов разного напряжения (показано цифрами около кривых, вольты). Б - различия в ХЛ ответах клеток здоровых доноров и больных семейной гиперхолестеринемией. Назначенное лечение - УФ - облучение крови ((УФ-ОК) оказалось неэффективным, если верить данному показателю. Результаты получены в клинике Гумбольдта, Берлин [5].

На рисунке 2 (А) в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же "хемилюминесцентные ответы" можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название "стимулов".