Без имени (стр. 15 )

Большое  значение  с  диагностической  точки  зрения  имеет  окрашивание капсул. Капсульные вещества слабо окрашивается и при простом методе окра-ски выступает в виде бледной каймы бесцветного или слабоокрашенного орео-ла вокруг микробной клетки. Для того чтобы лучше рассмотреть капсулы, ис-пользуют методы Михина, Муромцева, Ольта, Бурри-Гинса и др. В этих мето-дах используют один или несколько красителей. Так, для окраски капсул по

Бурри-Гинсу,  суспензию  слизеобразуюших  бактерий  смешивают  на  краю предметного стекла с каплей туши и с помощью другого предметного стекла распределяют тонким слоем по поверхности. Далее препарат фиксируют над пламенем горелки и окрашивают фуксином или сафранином. При микроскопии такого препарата на темном фоне отчетливо выделяются окрашенные в крас-ный цвет бактерии, окруженные бесцветными капсулами.

С другими специальными методами, позволяющими определить наличие и содержание запасных веществ в клетках (определение гликогена и волютина), студенты ознакомятся при исследовании качества производственных дрожжей

2.2  ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

На занятии студенты знакомятся с основными признаками, которые учи-тываются при идентификации микроорганизмов,  обращают внимание на мор-фологические признаки кокков и палочек, диагностическое значение сложных и дифференциальных  методов  окраски  бактерий.  Осваивают  технику  окраски бактерий по методу Грама. Определяют, какие из представленных для исследования бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным.

Готовят фиксированный мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий

Bacillus subtilis и окрашивают его по Шефферу-Фултону.

2.2.1 Окраска бактерий по методу Грама

Сущность метода заключается в различии химического состава и строе-ния клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. 

Клеточная стенка грам+ бактерий толстая, но однослойная, содержит мно-го пептидогликана – муреина, а также тейховые кислоты, которые образуют прочное соединение с красителями - генцианвиолетом и йодом и поэтому ос-таются окрашенными после обработки мазка спиртом. Таким образом, грам+ бактерии по методу Грама окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

У грам  бактерий клеточная стенка тонкая, но двухслойная. Муреина ма-ло, причем он содержится во внутреннем слое клеточной стенки, тейхоевые ки-слоты отсутствуют. Внешний слой клеточной стенки содержит, главным обра-зом, вещества, обладающие гидрофобными свойствами – липополисахариды и липопротеиды. Эти вещества не образуют прочного комплекса с красками ген-цианвиолетом и йодом и поэтому клетки обесцвечиваются после обработки 96 %-ным этиловым спиртом и после дополнительной окраски красителем фукси-ном окрашиваются в бледно-розовый цвет.

Техника окраски по Граму

1.  На предметном стекле готовят фиксированный мазок исследуемой чистой культуры;

2.  Мазок  окрашивают  красителем  генцианвиолетом  через  полоску  фильтро-вальной бумаги. Можно также использовать заранее приготовленные фильт-ровальные  бумажки,  смоченные  1  %-ным  спиртовым  раствором  кристал-лвиолета и высушенные (метод Грама в модификации ). В этом случае бумажки помещают на фиксированный мазок и смачивают несколь-кими каплями воды. Окраску препарата  проводят в течение 2…3 мин;

3.  Фильтровальную бумагу снимают с мазка, краску сливают и наносят на ма-зок раствор Люголя на 2 мин;

4.  Раствор Люголя сливают с мазка и обрабатывают 96 %-нам спиртом в тече-ние 30…60 сек. Затем препарат промывают водой и подсушивают фильтро-вальной бумагой;

5.  Мазок окрашивают красителем фуксином 2…3 мин, второй раз промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Затем  на  стекло  наносят  каплю  иммерсионного  масла  и  рассматривают препарат с объективом х90 или х100 при максимальном освещении.

2.2.2 Окраска спор бактерий по Шефферу-Фултону

Сущность метода  заключается в комбинированном действии концентри-рованного раствора красителя бриллиантового зеленого и температуры на ма-лопроницаемую оболочку спор с дальнейшим обесцвечиванием цитоплазмы вегетативной клетки и ее контрастным докрашиванием сафранином. Таким обра-зом, споры окрашиваются в зеленый цвет, а клетки – в красный. 

Техника окраски по Шефферу-Фултону

1.  На краю предметного стекла (на расстоянии примерно 1,5-2,0 см от края) го-товят густой нефиксированный мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий;

2.  На раствор наносят водный раствор бриллиантовой зелени, и мазок с крас-кой нагревают над пламенем горелки до появления пара. Нельзя допускать прикипания краски к мазку. Поэтому препарат периодически отстраняют от пламени. Нагревание мазка с краской проводят в течение 3 мин;

3.  Краску сливают, препарат быстро промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой;

4.  Окрашивают мазок раствором сафранина 2…3 мин, затем краску сливают, мазок вторично промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Далее на мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают под объективом на х90 или х100 при максимальном освещении. 

Оформление и анализ результатов исследований

В отчете  студенты кратко конспектируют теоретический материал и пере-писывают сущность и технику окраски бактерий по Граму и спор бактерий по Шефферу-Фултону. Зарисовывают микроскопические картины исследованных чистых  культур  бактерий  с  учетом  морфологических  особенностей  каждого микроорганизма.  Под  каждым  рисунком  подписывают  латинское  название микроорганизма, отношение его к окраске по Граму, увеличение исследованно-го объекта.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3

Методы определения микроорганизмов в воздухе, воде

Цель работы. Знакомится с методиками определения мик-роорганизмов в воздухе, воде и осуществлять посевы этих объектов на питательные среды. Готовить смывы с рук и далее проводят определение наличие кишечной палочки с использованием среды Кода.

3.1  Микробиологическое исследование воздуха седиментационным методом

Определяют  количество  мезофильных  аэробных  и  факультативно-анаэробных  микроорганизмов  (КМАФАнМ)  и  содержание  микроскопических грибов и дрожжей. Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см3 мясопеп-тонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на разверну-тую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была от-крыта полностью.

Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в за-висимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, перево-рачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 370С, а со средой Сабуро –  в течение 2-3 суток при 250С.

Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроор-ганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. 

Формула Омелянского:

Х = а1005100 / ST,  где  а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух); 

S – площадь чашки Петри, см2; 

Т – время экспозиции, мин;

100 – пересчет площади чашки на 100 см2;

5 – время экспозиции по Омелянскому,  мин;

100 – пересчет на 1 м3 воздуха.

3.2  Микробиологическое исследование воды

Отбор проб

Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном,

пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спуска-ют, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем. 

3.2.1 Определение общего микробного числа (КМАФАнМ) . 

Для посева отбирают по 1 см3 воды и переносят в 2 чашки Петри и зали-вают расплавленной и охлажденной до 45…50 0

С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два. 

3.2.2 Определение  общих и термотолерантных колиформных бактерий методом  мембранных фильтров

Метод  основан  на  фильтрации  установленного  объема  воды  через  мем-бранные  фильтры,  выращивании  посевов  на  дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации выросших колоний.

Для анализа точно отмеряют 100 см3 воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осто-рожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна  быть  обращена  вверх.  Чашки  с  фильтрами  ставят  в  термостат  дном вверх и инкубируют посевы при температуре 370С в течение 24 часов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью.

При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпеча-ток на обратной стороне мембранного фильтра и среде – темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных – розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 370С в течение

16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: ок-сидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 370С для определения общих колиформных бактерий и при 440С при определении термотолерантных колиформных бактерий.