Молекулярно-клеточные и морфологические особенности раннего фиброзирования легких мышей линии C57BL/6 при гриппе A/H5N1 A/GOOSE/KRASNOOZERSKOYE/627/05 (стр. 1 )

На правах рукописи

АНИКИНА АУРИКА ГЕОРГИЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАННЕГО ФИБРОЗИРОВАНИЯ ЛЕГКИХ МЫШЕЙ ЛИНИИ C57Bl/6 ПРИ ГРИППЕ A/H5N1 A/GOOSE/KRASNOOZERSKOYE/627/05

03.03.04. – клеточная биология, цитология, гистология

14.03.02. – патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

ФГБОУ ВПО НГУ

профессор кафедры физиологии

факультета естественных наук

доктор медицинских наук

ГБОУ ВПО НГМУ Минздрав России

профессор кафедры гистологии,

эмбриологии и цитологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение НИИ Региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск)

Защита состоится «___»_________2012 г. в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при ФГБУ НЦКЭМ СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2; г. Новосибирск, 630117; тел/–64–56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НЦКЭМ СО РАМН.

Автореферат разослан «___» сентября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д. б.н.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Грипп относят к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), которые занимают одно из первых мест в структуре инфекционных заболеваний. По данным ВОЗ, ежегодно в мире болеет гриппом от 3 до 5 млн. человек, эпидемии гриппа ежегодно уносят жизни 250–500 тыс. человек (ВОЗ; , 2003). Заболеваемость гриппом высока во всех возрастных группах. Смертность от гриппа отчетливо приходится на лиц пожилого возраста, наиболее часто связанная с обострением имевшихся у пациента заболеваний (сердечно-сосудистых, респираторных, болезней обмена) (, , 2004; и др., 2007; , 2008; Bhat N. et al., 2005).

Основные эпидемии гриппа ХХ века были вызваны вирусами гриппа птиц модифицированных путем генетической реассортации между штаммами гриппа птиц и людей (пандемии 1957 и 1968 гг.) или адаптации птичьего штамма вируса гриппа к человеку («испанка» гг.) (Claas E. C., 2000).

Грипп птиц в XXI веке приобретает значение мировой проблемы, поскольку вирус гриппа преодолел межвидовые барьеры и обрел способность вызывать заболевание у человека, как это случилось в 1997 г. в Гонконге (Claas E. C. et al., 1998; Osterhaus A. D. et al., 2002), в декабре 2003 г. в Юго-Восточной Азии, вызвав вспышки заболевания в разных странах (, 2005; и др., 2006; и др., 2006; Tarantola A. et al., 2010). В дальнейшем оказалось, что вирусы гриппа А/H5N1, выделенные от заболевших в 2004 г., подверглись дополнительной мутации. Большая часть мутировавших вирусов оказались резистентными к римантадину (, , 2008). В 2005 г. и первом квартале 2006 г. зарегистрированы заболевания гриппом А/Н5N1 среди перелетных и домашних птиц на территории РФ ( и др., 2007).

По данным ВОЗ на 29 декабря 2010 года заболеваемость человека гриппом птиц зарегистрирована в 58 странах мира, а общее количество вирусологически подтверждённых случаев заболевания людей, вызванного штаммами субтипа А/H5N1, составило 512, из которых %) закончились летальным исходом, при этом среди детей до 15 лет летальность при гриппе А/H5N1 достигает 89% (ВОЗ).

В ходе исследований было отмечено, что у инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 людей и лабораторных животных развивается острый респираторный дистресс-синдром и ранний интерстициальный фиброз легких ( и др., 2008; To K. F., et al., 2001; Kortweg C., Gu J. et al., 2008; Qiao J. et al., 2009). Фиброз легких, развивающийся в столь короткие сроки и не характерный для острых инфекций, является одним из осложнений, приводящих к инвалидизации и ведущим к смерти больных. Феномен раннего (в остром периоде инфекционного заболевания) фиброза представляет большой интерес с позиций общей патологии, особенно при вирусной инфекции, поскольку патогенез его не изучен. Имеются лишь отдельные сообщения феноменологического характера о раннем фиброзе при инфицировании вирусом гриппа A/H5N1. Его высокая потенциальная опасность для человека, резистентность к немногочисленным противовирусным препаратам и плохо изученный патогенез предполагает актуальность дальнейшего детального изучения патогенеза данного заболевания. В частности, большой интерес представляет ранний фиброз легких – одно из важнейших патогенетических факторов, обусловливающих высокую летальность в связи с развитием острой легочной, а затем сердечной недостаточности у инфицированных людей и животных.

Цель исследования. Исследовать молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности фиброгенеза легких после инфицирования вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 мышей линии C57Bl/6.

Задачи исследования:

1.  Методом флуоресцентной микроскопии и с помощью ИГХ анализа изучить топологию вируса.

2.  Изучить общие патоморфологические изменения в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в процессе развития заболевания.

3.  Исследовать масштабы фиброза в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.

4.  Изучить содержание различных типов коллагена в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.

5.  Изучить изменения количества фибробластов, оценить их пролиферативную, «фибропластическую активности» в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.

6.  Изучить особенности экспрессии факторов роста и их рецепторов, провоспалительных цитокинов, матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в патогенезе раннего фиброза легких у мышей линии С57Bl/6, инфицированных штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в разные периоды инфекционного процесса.

Научная новизна. Впервые в эксперименте исследованы изменения и вероятные механизмы нарушения и восстановления структурно-функционального гомеостаза в легких в целом и системе соединительной ткани (внеклеточного матрикса) легких мышей линии C57Bl/6 после их инфицирования высокопатогенным штаммом вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05. Показано, что характер деструктивных процессов помимо цитопатических эффектов вируса детерминирован вторично развивающимися патологическими структурно-функциональными изменениями, детерминирующими и усиливающими состояние гипоксии клеток и структур легких и в целом в организме.

Впервые показано, что инфицирование животных этим вирусом сопряжено с инфицированием их фибробластов и макрофагов. При этом получены свидетельства того, что инфицирование этих клеток вирусом A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 является триггерным механизмом для «запуска» процессов пролиферации фибробластов, увеличения их численности, экспрессии MMPs и их ингибиторов (MMP-2, MMP-9, MMP-10, TIMP-2) фибробластами и макрофагами легких, регулирующих процессы обмена структур внеклеточного матрикса, поскольку изменения величин, характеризующих эти процессы, не имели очевидной корреляционной зависимости от уменьшения количества инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 фибробластов.

Впервые показано, что в рассматриваемой экспериментальной модели раннее фиброзирование легких детерминировано дисрегуляцией, вероятно, неспецифических механизмов репаративной (substitucio) регенерации и механизмов гомеостазирования в системе соединительной ткани, возможно в связи с продолжающейся персистенцией вируса в исследованных и иных клетках организма. Впервые показано, что усиление фибробластами легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 экспрессии провоспалительных цитокинов (TNF-α и IL-6) сопряжено с усилением процесса воспаления и в итоге усилением фиброзирования легких.

Научно-практическая значимость. Полученные данные свидетельствуют о том, что основным фактором, индуцирующим и поддерживающим раннее фиброзирование в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 является инфицирование фибробластов и продолжающееся персистирование в них и макрофагах вируса, приводящее к дискоординации процессов гомеостазирования в системе соединительной ткани легких. Эти данные указывают на необходимость разработки средств профилактики проникновения вируса гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 в клетки, в частности фибробласты и макрофаги или разработку средств эффективного уничтожения вирусов. Полученные результаты уточняют ряд патогенетических механизмов повреждения легких и развития одного из основных осложнений, в частности раннего фиброза легких, дополняют традиционные представления об этапах развития воспаления, в частности его репаративной фазы при инфицировании млекопитающих вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на гг.», госконтракт № 02.740.11.0709.

Положения, выносимые на защиту:

1.  Инфицирование мышей линии C57Bl/6 вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 сопряжено с персистированием его в фибробластах и макрофагах, развитием деструктивных процессов в легких, сопряженных с развитием вторичной острой гипоксии, обусловленной как дыхательной недостаточностью, так и формирующимся капиллярно-паренхиматозным блоком, препятствующим газообмену. Это является триггерным фактором для формирования патогенетической цепи дисрегуляторных и метаболических изменений в системе соединительной ткани легких, а продолжающаяся дискоординация процессов гомеостазирования в ней поддерживается персистенцией вируса в этих клетках.

2.  Процессы раннего фиброзирования индуцированы вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 и поддерживаются развившейся гипоксией, ранней и активной пролиферацией фибробластов легких, их дифференцированием и последующим увеличенным синтезом структур внеклеточного матрикса: коллагеновых, ретикулярных и эластических волокон, коллагенов I, III, IV и VI типов.

3.  Процесс фиброзирования легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 регулируется ростовыми факторами FGF и EGF и их рецепторами, экспрессируемыми как самими фибробластами, так и макрофагами. Фиброз как процесс неполноценной репарации легких (substitucio) развивается после повреждения, а также в ответ на острую гипоксию и обусловлен дискоординацией процессов гомеостазирования в системе соединительной ткани в связи с недостаточной активностью ММРs (MMP-2, MMP-9, MMP-10), ограничиваемых высокой экспрессией TIMP-2. Экспрессия фибробластами провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6 усугубляет фиброзирование легких через механизм стимуляции пролиферации фибробластов и продуцирование ими структур внеклеточного матрикса.

Внедрение результатов работы в практику. Основные положения работы внедрены в практику преподавания на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО НГМУ Минздрав России в раздел «Воспаление», «Инфекционные болезни», «Регенерация».

Апробация работы. Материалы исследований доложены на IV Международной Научно-практической Конференции молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы: 65 отечественных и 212 зарубежных источников. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 33 рисунка. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве инфекционного агента был выбран вирус гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, выделенный из легкого гуся, погибшего во время вспышки гриппа птиц в селе Кразнозерское Новосибирской области в сентябре 2005 года. Экспериментальные работы с вирусами гриппа А/H5N1 были проведены в лаборатории отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) в соответствии с санитарными правилами безопасности работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности и гельминтами (СП 1.2.731 от 25.01.05).

Работа выполнена на 90 мышах-самцах линии С57Bl/6, в возрасте 2 месяцев с массой г (питомник лабораторных животных НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище. Перед проведением эксперимента их адаптировали к условиям содержания. Исследование проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 01.01.2001 г. № 000), с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации. Учитывая, что в популяции млекопитающих и человека, в частности, основной путь передачи вируса гриппа А является воздушно-капельный, то инфицирование мышей проводили интраназально дозой равной 5 МЛД50.

Для проведения эксперимента было сформировано 3 подопытных группы животных:

Первая группа – контрольная – была представлена 20 интактными мышами линии C57Bl/6.

Вторая группа состояла из 50 мышей, которых инфицировали вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05.

Третья группа состояла из 20 мышей, которых инфицировали вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05, у которых изучали патогенность штамма по показателю летальности животных, выраженного в процентах.

Для исследования биологического материала экспериментальных животных первой и второй групп выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе. Сбор материала проводили на 1, 3, 6, 10 и 14 сутки после инфицирования. Объектом исследования служили легкие.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП Фгбу «Нцкэм со рамн» «современные оптические системы».

Для светооптического исследования, полученный материал, после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ксилолов и заключали в синтетическую парафиновую смесь «HISTOMIX» (BioVitrum, Россия). Срезы изготавливали на микротоме («MICROM», Германия) толщиной 3,5 мкм. Окраску проводили по стандартной методике гематоксилином и эозином (обзорная), пикрофуксином по методу ван Гизон азотнокислым серебром, орсеином с целью оценки объемной плотности волокнистой соединительной ткани (дифференциация коллагеновых, ретикулярных и эластических волокон).

Проводили ИГХ анализ с использованием непрямого AEC (стрептавидин-пероксидазного) метода для оценки: объемной плотности эндогенного коллагена в легких; пролиферативной, функциональной и профибротической активности фибробластов и легочных макрофагов, исследования численной плотности клеток, экспрессирующих ростовые факторы и их рецепторы, провоспалительные цитокины, матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы с использованием специфических первичных антител.

Для проведения ИГХ исследования срезы легких подвергали депарафинизации, регидратации, демаксировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700W, в течение 20-25 минут. Затем, после однократного промывания в дистиллированной воде и фосфатном буфере (PBS), производили блокирование эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. Экспозицию с первичными антителами проводили согласно инструкциям производителей. Затем срезы инкубировали с HRP-конъюгатом и вторичными антителами (система детекции «Spring Bioscience»), далее обрабатывали DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Затем проводили по спиртам возрастающей концентрации и ксилолам, покрывали синтетической покровной средой «Bio Mount» (Bio Vitrum, Россия) и заключали под покровное стекло.

Топологию вируса в фибробластах определяли методом иммунофлуорисценции – непрямого анализа с использованием первичных антител, меченых флуорохромом FITC, на антиген вируса Influenza A («Abcam»), с использованием стандартной методики приготовления препаратов с помощью конфокального лазерно-сканирующего микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss). В качестве контроля использовали нативные образцы, которые предварительно депарафинизировали стандартным методом.

Анализ гистологических препаратов проводили на микроскопе AxioImager A1 c фотокамерой AxioCam MRc (Carl Zeiss). Морфометрию структурных элементов тканей осуществляли с помощью окулярной сетки из 100 точек площадью 3,64х105 мкм2 (при определении численной (Nai) и/или объемной (Vv) плотности структур) (Автандилов, 2000) и инструментов программы AxioVision (rel. 4.8.2).

В ходе данной работы определяли объемную плотность (Vv) фиброзной ткани: коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон. Оценивали численную плотность (Nai) фибробластов, PCNA+фибробластов, фибробластов, экспрессирующих антиген вируса Influenza A. Изучали численную плотность (Nai) клеток легких, экспрессирующих исследуемые маркеры: MMPs, TIMP-2, FGF, FGFR, EGF, EGFR. Расчет «фибропластической активности» проводили по соотношению объемной плотности коллагеновых волокон к численной плотности фибробластов, то есть по количеству коллагена приходящегося на один фибробласт (, 2007) в закрытой тестовой системе.

Средние величины исследованных параметров определяли с помощью пакета статистического анализа Microsoft Office Excel 2007, а также с использованием стандартного пакета программ STATISTICA v.6. Определяли средние арифметические величины (M), стандартную ошибку средней величины (m). Для выявления вероятности достоверности различий сравниваемых средних величин применяли t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р<0,05. Также проводили корреляционный анализ по Пирсону.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Летальность и средняя продолжительность жизни мышей линии С57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При исследовании патогенности вируса гриппа A/Н5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для мышей линии С57Bl/6 использованного в дозе 5 МЛД50, наблюдали гибель животных, начиная с 10 суток после инфицирования. По окончании срока наблюдения (14 сутки) летальность инфицированных животных составила 70% при показателе средней продолжительности жизни животных – 12,3 суток. Гибели интактных мышей контрольной группы не наблюдали. Полученные данные подтверждают высокую патогенность вируса гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 для млекопитающих.

Структурные изменения в легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

При гистологическом исследовании легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoe/627/05 обнаружили деструктивные процессы, представленные: некрозами, зонами ателектазов и острой эмфиземы, а также кровоизлияниями, отеком и инфильтратами (см. табл. 1), что также было обнаружено рядом других авторов у беспородных мышей и хорьков при иных инфицирующих дозах с использованием различных штаммов вируса гриппа A/H5N1 ( и др., 2008; Bodewes R. et al., 2011; Fukushi M. et al., 2011).

Показатель объемной плотности патоморфологических изменений (некрозы, ателектазы, эмфизема) был максимальным на 10 сутки эксперимента и составлял около 60% легких инфицированных мышей. К 14 суткам величина исследуемого показателя составляла почти 30% от объема легкого (см. табл. 1). Величина объемной плотности кровоизлияний была максимальной на 6 сутки и составляла более 30% от общего объема легких, с последующим снижением на 10% на 10 сутки. К 14 суткам показатель объемной плотности кровоизлияний составлял 10% (см. табл. 1). На 10 сутки инфекционного процесса показатель объемной плотности зон отека был максимальным и составлял более 60%, с последующим снижением на 14 сутки, что соответствовало 30% от общего объема легких (см. табл. 1). Кроме того, деструктивные изменения в легких инфицированных мышей были представлены инфильтратами, которые уже в 1 сутки эксперимента составляли более 20% от общей площади легочной ткани. Максимальным показатель объемной площади инфильтратов был на 6 сутки и составлял более 30%. На более поздних сроках исследования наблюдали снижение показателя объемной плотности инфильтратов на 10% на 10 сутки и на 17,5% на 14 сутки, относительно 6 суток после инфицирования (см. табл. 1). Клеточный состав инфильтратов был представлен макрофагами, лимфоцитами и фибробластами.

Таблица 1

Результаты исследования патоморфологических изменений в легких мышей после инфицировании вирусом гриппа А/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 (M±m)

Объект и параметры исследования	Сутки после инфицирования	Мыши линии C57Bl/6
Интактные	Инфицированные**
Объемная плотность деструктивных изменений* (Vv), %	1	0,3±0,1	16,6±1,42a
3	20,3±2,05ab
6	59,2±2,54ab
10	59,9±1,62ac,542ная плотность зон отека ний ()ких изменений (
14	27,7±1,44ab
Объемная плотность кровоизлияний (Vv), %	1	5,6±0,8	17,35±1,61a
3	24,3±2,056ab
6	31,7±2,52ab
10	20,2±2,67ab
14	10,5±0,72ab
Объемная плотность зон отека (Vv), %	1	0,2±0,1	15,4±1,15a
3	24,8±1,63ab
6	39,2±1,48ab
10	63,5±0,85ab
14	29,4±1,23ab
Объемная плотность инфильтратов (Vv), %	1	4,1±0,06	22,0±2,25a
3	29,6±3,53ab
6	33,8±3,24a
10	21,4±3,35ab
14	16,5±1,28ab

Примечания:

«а» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров инфицированных мышей по сравнению с аналогичными показателями у мышей в контрольной группе;

«b» - достоверность отличия средних величин рассматриваемых параметров с предыдущим периодом исследования.

* - Патоморфологические изменения – некроз, отек, эмфизема.

**- Приведенные данные в ряде случаев учитывают объемную плотность (Vv) патоморфологических изменений, топологически идентифицируемых в одних и тех же структурах при микроскопическом и морфометрическом исследовании. Например – ателектазы и инфильтраты, зоны некрозов с зонами клеточной воспалительной инфильтрации и отека.

Результаты исследования компонентов внеклеточного матрикса (коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон) легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05

В работах ряда авторов помимо деструктивных изменений, в легких инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 животных, обнаруживали развитие быстро прогрессирующего раннего фиброза ( и др., 2008; и др., 2009; Qiao J. et al., 2009).

При гистологическом исследовании образцов легких мышей линии C57Bl/6, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 A/goose/Krasnoozerskoye/627/05 на 1-3 сутки эксперимента наблюдали увеличение объемной плотности коллагеновых волокон, обнаруженных преимущественно периваскулярно и перибронхиально. Начиная с 6 суток после инфицирования, коллагеновые волокна появлялись в зонах инфильтратов и ателектазов.

Уже в 1 сутки после инфицирования показатель объемной плотности коллагеновых волокон был больше по сравнению с величиной аналогичного показателя в группе контроля в 2 раза. В последующие периоды эксперимента наблюдали постепенное нарастание величины показателя объемной плотности коллагеновых волокон, достигающего максимума к 14 суткам, что составляло увеличение в 7 раз по сравнению с 1 сутками инфекционного процесса (см. табл. 2).