Молекулярно-генетические аспекты клинического течения, дифференциальной диагностики и патогенетической терапии гипертрофии левого желудочка при гипертонической болезни и гипертрофической кардиомиопатии (стр. 1 )

на правах рукописи

СМИРНОВА

Мария Дмитриевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ГИПЕРТРОФИИ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА ПРИ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ И ГИПЕРТРОФИЧЕСКОЙ КАРДИОМИОПАТИИ.

14.01.05 – кардиология

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2010

Работа выполнена в научно – диспансерном отделе и лаборатории медицинской генетики Института клинической кардиологии им. ФГУ «Российский кардиологического научно – производственного комплекса МЗ и СР РФ».

Научные руководители:

доктор медицинских наук Агеев Фаиль Таипович

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук,

профессор

Доктор медицинских наук

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет им. МЗ и СР РФ»

Защита диссертации состоится «__» __________2010 г в 13 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук ФГУ «РКНПК МЗ и СР РФ» ( Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «РКНПК МЗ и СР РФ»

Автореферат разослан « __» __________________2010

Ученый секретарь

Диссертационного совета

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ – артериальная гипертензия

АД – артериальное давление

АПФ – ангиотензин-превращающий фермент

АТ II – ангиотензин II

БРА – блокаторы рецепторов к ангиотензину II

ВТЛЖ – выносящий тракт левого желудочка

ГБ – гипертоническая болезнь

ГКМП – гипертрофическая кардиомиопатия

ГЛЖ – гипертрофия левого желудочка

ДАД – диастолическое артериальное давление

ЖТ – желудочковая тахикардия

ЗС – задняя стенка левого желудочка

ИММЛЖ – индекс массы миокарда левого желудочка

ИС – индекс сферичности

КДР – конечно - диастолический размер

КСР – конечно - систолический размер

ЛП – левое предсердие

ЛЖ – левый желудочек

МЖП – межжелудочковая перегородка

ОТС – относительная толщина стенок

РААС – ренин – ангиотензин – альдостероновая система

САД – систолическое артериальное давление

ф. к. – функциональный класс

ФК ХСН – ф. к. хронической сердечной недостаточности

АСЕ – ген ангиотезинпревращающего фермента

ATR1 – ген рецептора 1-го типа к ангиотензину II

Е/E’ - отношение максимальных скоростей раннего диастолического наполнения ЛЖ (Е) к максимальной скорости раннего диастолического движения фиброзного кольца (Е’)

G втлж – градиент давления в выносящем тракте левого желудочка

SDNN - стандартное отклонение всех анализируемых RR интервалов

Vp - скорость распространения раннего диастолического кровотока в левом желудочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Крупные эпидемиологические исследования продемонстрировали, что гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ) является независимым фактором риска развития сердечно-сосудистых осложнений[Kannel W. B. 1996]. Известно, что гипертрофия левого желудочка, как морфологический признак изменения миокарда, является основным признаком гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП). Однако ГЛЖ нередко встречается и при других нозологиях, чаще всего (приблизительно в 30 % случаев) при гипертонической болезни ( ГБ). Параллельное клинико-генетическое исследование больных ГБ с ГЛЖ и ГКМП может послужить лучшему пониманию механизма развития гипертрофии левого желудочка, носящего мультифакториальный характер, а так же разработке патогенетически обоснованной терапии этого состояния. Имеются данные о модифицирующей роли ключевых генов ренин – ангиотензин - альдостероновой системы (РААС): гена, кодирующего АПФ (АСЕ), и гена, кодирующего рецептор к ангиотензину II(АТ II) первого типа(ATR1), - в генезе ГЛЖ как при ГБ[Schunkert H, 1994], так и при ГКМП[Seferovic P. M. 1995; Osterop APRM, 1998]. Однако вопрос этот на сегодняшний день недостаточно изучен.

Имеются данные, что терапия блокаторами рецепторов к ангиотензину II(БРА) вызывает регресс гипертрофии не только у больных ГБ [Lindholm L. H, 2002], но и при ГКМП [Penicka M., 2009; Hiroaki K. 2005], что открывает новые возможности для патогенетически обоснованной терапии последней, которая, к сожалению, в настоящее время носит чисто симптоматический характер. Заслуживает внимания возможная связь гипотензивной и антигипертрофической эффективности этих препаратов с полиморфизмом генов, кодирующих точку их приложения – рецептор AT II, в настоящее время практически неизученная. Наличие такой зависимости позволит в будущем прицельно назначать препарат в тех случаях, где он потенциально эффективен.

Цель работы.

Целью исследования является оценка особенностей развития гипертрофии миокарда левого желудочка, клинической картины заболевания и эффективности блокаторов рецепторов к ангиотензину II в зависимости от полиморфизма генов – предикторов ГЛЖ у больных с ГКМП и с ГБ.

Задачи работы

1.  Оценить особенности развития ГЛЖ (локализацию, выраженность, клинические проявления) при ГКМП и с ГБ.

2.  Оценить распределение различных полиморфизмов генов ACE I/D и ATR1 A1166C(A/C) при ГКМП с АГ и без и при ГБ с ГЛЖ и без, а так же в здоровой популяции.

3.  Оценить влияния изучаемых полиморфизмов генов ACE и ATR1 на выраженность ГЛЖ и клиническую картину заболевания при ГКМП и ГБ

4.  Оценить влияние полиморфизма генов ACE и ATR1 на эффективность терапии БРА ирбесартаном больных ГКМП и ГБ с ГЛЖ.

Научная новизна

В ходе исследования впервые сравнивались группы больных с ГКМП и ГБ c морфологически сходной ГЛЖ с точки зрения клинической, электрокардиографической и эхокардиографической картины заболевания и характера полиморфизма генов АСЕ и ATR1, причем особое внимание уделялась больным ГКМП с присоединившейся АГ. Впервые на московской популяции проводилась сравнительная оценка распределения полиморфных аллелей вышеуказанных генов у пациентов с ГЛЖ по сравнению с больными ГБ без ГЛЖ, и со «здоровой популяцией». Оценено влияние полиморфизма генов РАС на клинические и клинико-инструментальные показатели у больных с ГЛЖ различной этиологией. Выявлено разнонаправленное действие данных полиморфизмов при различных нозологиях. Так при ГКМП протективным является аллель I гена АСЕ, а при ГБ, напротив, аллель D. При ГКМП генотип АА гена ATR1 ассоциируется с более тяжелым клиническим течением по сравнению с генотипом АС, однако не влияет на степень ГЛЖ. При ГБ+ГЛЖ, напротив, носительство генотипа АА ATR1 ассоциируется с большей степенью ГЛЖ, но не влияет на тяжесть клинических проявлений заболевания.

В ходе исследования так же была изучена эффективность ирбесартана при различных нозологиях и ее связь с полиморфизмом гена ART1 и АСЕ. Впервые была оценена эффективность ирбесартана при ГКМП. Показано, что достоверный клинический и антигипертрофический эффект был достигнут только у носителей генотипа АА ATR1. Носители аллеля D ACE более чувствительны к терапии ирбесартаном, чем гомозиготы II. При ГБ+ГЛЖ носители АА ATR1 более чувствительны к гипотензивному влиянию БРА, а носители аллеля С отвечают на терапию достоверным регрессом ГЛЖ независимо от гипотензивного эффекта препарата. Впервые выделена группа пациентов – носителей генотипа АС/CC ATR1+ID ACE, у которых достигается максимальный регресс ГЛЖ при минимальном снижении уровня АД.

Практическая значимость.

Показано, что наличие генотипа АА ATR1 предполагает более тяжелое течение заболевания при обеих нозологиях: большую тяжесть клинических проявлений при ГКМП и большую выраженность ГЛЖ при ГБ. Показано, что носительство генотипа II ACE при ГБ уменьшает вероятность развития ГЛЖ, тогда как при ГКМП предполагает большую выраженность ГЛЖ.

В ходе исследования доказана безопасность терапии ирбесартаном при ГКМП. Достоверный положительный эффект достигается только у носителей генотипа АА ATR1. тогда как носителям генотипа АС ATR1 ирбесартан назначать нецелесообразно. Показано, что носители аллеля D ACE более чувствительны к терапии ирбесартаном, чем гомозиготы II.

Показано, что при ГБ с ГЛЖ ирбесартан эффективен при всех изученных вариантах генотипов. В то же время, было выявлено, что носители генотипа АА ATR1 более чувствительны к гипотензивному влиянию ирбесартана, но не к их влиянию на регресс ГЛЖ. Доказана высокая эффективность ирбесартана в плане регресса ГЛЖ у носителей аллеля C ATR1, независимо от гипотензивного эффекта препарата. Носители генотипа ID ACE высоко чувствительны к антигипертрофическому. а у гомозигот DD отчетливее выражен гипотензивный эффект препарата и улучшение диастолической функции. Показано, что у носителей генотипа АС/CC ATR1+ID ACE, при лечении ирбесартаном, достигается максимальный регресс ГЛЖ при минимальном снижении уровня АД. Полученные результаты позволяют оптимизировать лечение больных с ГЛЖ при ГКМП и ГБ.

Внедрение в практику.

Результаты работы внедрены в практику лечебной и научной деятельности научно – диспансерного отдела НИИ кардиологии им. ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Подана заявка (регистрационный № /14(027724) на изобретение: «Способ лечения больных гипертрофической кардиомиопатией», принято решение р выдаче патента.

Апробация диссертации состоялась 10 февраля 2010 года на межотделенческой конференции Институте клинической кардиологии им. ФГУ Российского кардиологического научно – производственного комплекса Росмедтехнологий. Диссертация рекомендована к защите.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, раздела собственно результатов, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 159 источников. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Общая характеристика обследованных больных.

В исследование было включено 275 человек. Нами были сформированы 4 группы: две основные (больные с ГЛЖ), и две группы сравнения.

1 основная группа. Больные ГКМП - 35 человек(18 мужчин и 17 женщин, 45,4±15,9 лет). Диагноз ГКМП устанавливался в соответствии с рекомендациями ВОЗ(1995) на основании наличия утолщения миокарда ЛЖ>1,5 см при отсутствии других причин развития гипертрофии (артериальная гипертония(АГ), врожденный или приобретенный порок либо другое заболевание сердца). В особую подгруппу были выделены 16 больных, у которых при исходном диагнозе ГКМП с течением времени сформировалась АГ.

2 основная группа. Больные ГБ с ГЛЖ (ГБ+ГЛЖбольных (17 мужчин и 18 женщин, 58,6±10,9 лет). Критерием включения служило наличие ГЛЖ с Тмжп не менее 1,5 см. Исключались больные с клапанными и врожденными пороками сердца, дилатацией полости ЛЖ, симптоматической АГ.

Дифференциальная диагностика была основана на данных анамнеза и динамического наблюдение (4,0 года Ме 2,0(2,8;6,3)) в условиях научно – диспансерного отдела НИИ кардиологии имени. , включавшего повторное проведение ЭКГ, ЭхоКГ, суточного мониторирования АД, магнитно – резонансную томографию сердца.

Кроме того, для оценки характера распределения изучаемых аллелей нами были сформированы две группы сравнения:

1.  Группа больных ГБ без ГЛЖ (ГБ без ГЛЖ): 29 человек (16 мужчин и 13 женщин, 57,0+14,0). Группа больных ГБ без ГЛЖ достоверно не отличалась от группы ГБ+ГЛЖ по возрасту, полу, давности заболевания, цифрам АД.

2.  Контрольная группа («здоровая популяция»), в которую вошли 174 здоровых донора из Москвы и Московской области. 112 мужчин и 62 женщины, ср. возраст 44,03+9,6.лет. Группа по возрасту была сопоставима с группой больных ГКМП, однако достоверно отличалась от групп больных ГБ, как с ГЛЖ, так и без. Гендерный состав сопоставим во всех 4 группах. Всем донорам перед забором крови измерялось АД(122,3±5,1 и 76,8±6,4 мм рт. ст.), лица с АД>140/.90 мм рт. ст. исключались. Выборочно(n= 20) этим лицам была сделана ЭКГ, признаков ГЛЖ не выявлено. Данная группа отвечает понятию «здоровая популяция», и в качестве таковой участвовала в нашем исследовании.

Оценка клинической картины заболевания. Оценивались цифры офисного систолического и диастолического артериального давления (САД и ДАД), функциональный класс хронической сердечной недостаточности (ФК ХСН), функциональный класс (ф. к.) стенокардии напряжения, наличие синкопальных состояний, жалоб на сердцебиения.

Для интегральной оценки динамики клинических проявлений нами была разработана система баллов, отражающая следующие параметры:

·  ФК ХСН - от 0 до 4 баллов (соответствует ф. к. ХСН),

·  стенокардия напряжения, ф. к. - от 0т до 4 баллов (аналогично),

·  наличие/ отсутствие синкопальных состояний – 1/0,

·  наличие/ отсутствие жалоб на сердцебиения – 1/0

Электрокардиография проводилась на приборе МАС-500. Оценивался индекс Соколова – Лайона, глубина депрессии ST в левых грудных отведениях.

Эхокардиография выполнялась на аппарате Philips IE33 фирмы «Philips”. В ходе исследования определялись: толщина миокарда задней стенки левого желудочка (Тзс) и межжелудочковой перегородки (Тмжп), конечный систолический (КСР) и диастолический (КДР) размеры левого желудочка, переднезадний левого предсердия (ЛП), фракцию выброса, а так же индекс массы миокарда ЛЖ (ИММЛЖ), градиент давления в выносящем тракте ЛЖ ( G ВТЛЖ). Особенности процесса ремоделирования ЛЖ характеризовали диастолическим индексом сферичности (ИС), относительной толщиной стенок (ОТС). Для оценки состояния диастолической функции ЛЖ определялись следующие показатели: соотношение максимальных скоростей раннего диастолического наполнения ЛЖ (Е) и наполнение в систолу предсердий (А) – Е/А; время замедления кровотока раннего диастолического наполнения левого желудочка(deceleration time, DT); время изоволюметрического расслабления ЛЖ; отношение Е к максимальной скорости раннего диастолического движения фиброзного кольца (Е’) – Е/E’, скорость распространения раннего диастолического кровотока в левом желудочка – Vp, отношение Е/Vp.

Холтеровское мониторирование ЭКГ проводилось на приборе "Astrocard" . Оценивались частота сердечных сокращений, число наджелудочковых и желудочковых экстрасистол, число пробежек наджелудочковой и желудочковой (ЖТ) тахикардии и количество вошедших в них комплексов, стандартное отклонение всех анализируемых RR интервалов(SDNN).

Выделение ДНК из замороженной цельной крови методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К

Кровь собирали с ЭДТА в качестве антикоагулянта, перемешивали на вортексе и осаждали клеточный осадок центрифугированием К клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протееиназы К1 и фермент сток-раствора. После разделяли фазы центрифугированием. Осадок растворяли в 200 мкл Т10Е1-буфера* (10мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1мМ ЭДТА).

Для определения аллелей полиморфного участка A1166C гена рецептора (тип 1) ангиотензина II использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq ( ЗАО "Силекс"), рестриктазу BstDEI ( ТОО "Сибэнзим") , олигонуклеотидные праймеры (ЗАО "Синтол"). Полиморфный участок гена ATR1 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификацию полиморфного участка гена проводили на амплификаторе MJ Research PTC-200. Продукты расщепления разделяли с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле. Фрагмент ДНК, содержащий аллель C1166, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п. н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель A1166, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п. н. соответствует генотипу AA, двух фрагментов (114 и 238 п. н.) - генотипу CC и трех (114, 238 и 352 п. н.) – гетерозиготе AC

Полиморфный участок гена ACE амплифицировали с помощью ПЦР, проводимой на амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorff AG, Germany). В результате амплификации происходило образование двух продуктов: 190 п. о. (аллель D с делецией) и 480 п. о. (аллель I, содержащий вставку). Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле.

Статистический анализ проводился с помощью пакета программ Statistica 6.0 for Windows. Все анализируемые показатели были протестированы на предмет их нормального распределения. При анализе межгрупповых различий количественных показателей рассчитывали значения t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Для оценки значимости отличий до и после лечения был использован тест Стьюдента с раздельными оценками дисперсий. Сравнение значений с распределением признаков отличным от нормального проводился с помощью критерия Вилкоксона и Мак - Уитни.  Сравнение распределения качественных признаков проводили с использованием точного критерия Фишера. Различия считали статистически достоверными при вероятности абсолютно случайного их характера не превышающей 5%(p<0,05). Данные представлены в виде M±SD при нормальном распределении признака или Me(-95%ДИ;+95%ДИ) – при асимметричном.

Дизайн исследования.

I этап. Оценка распределения полиморфных аллелей изучаемых генов при ГКМП, ГБ с ГЛЖ и без и в так называемой «здоровой популяции».

•  Выделения геномной ДНК

•  Полимеразная цепная реакция

•  Прямое секвенирование участков ДНК методом пиросеквенирования

•  Анализ полиморфизма рестрикционных (лат. фрагментов

II этап. Оценка клинической и морфологической картины заболевания у больных с различными полиморфными аллелями генов АСЕ и ATR1 у больных ГКМП и ГБ+ГЛЖ. Обследование включало:

•  клиническое обследование больных

•  измерение офисного АД

•  ЭКГ

•  ЭХО-КГ

•  ЭКГ-мониторирование

III этап. Оценка эффективности блокатора рецепторов к ангиотензину II ирбесартана у больных с ГКМП и ГБ+ГЛЖ.

Участвовали 22 пациента c необструктивной ГКМП (47,3±15,7 лет, 12 мужчин и 10 женщин) и 23 - с ГБ+ГЛЖ (60,0±11,7 лет, 10 мужчин и 13 женщин). 13 больных ГКМП с АГ (59,1%). Критерии исключения: обструкция выносящего тракта ЛЖ(G втлж > 25 мм рт. ст.), симптоматическая артериальная гипотензия, отказ пациента от участия в исследовании. Пациенты получали ирбесартан в течение 6 мес. с последующим повторным обследованием. Средняя доза - 150,0 ± 55,3 мг/сутки при ГКМП и 175,2±69,8 мг/сутки при ГБ+ГЛЖ (разница нд.). Базовая терапия оставалась неизменной.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Сравнительная характеристика больных с различными формами ГЛЖ.

Обе группы больных с ГЛЖ были сопоставимы по полу и длительности заболевания. Клиническая характеристика больных представлена в табл. 1. Больные с ГБ+ГЛЖ были сравнительно старше больных с ГКМП. Единственным значимым клиническим различием больных с ГКМП и ГБ+ГЛЖ был уровень офисного АД. Различий между группами не было ни по данным ЭКГ, ни по данным холтеровского мониторирования. В подгруппе ГКМП+АГ больше выраженность вольтажных признаков ГЛЖ. В группе ГКМП чаще встречалась асимметричная септальная гипертрофия(85%), в группе ГБ+ГЛЖ это форма гипертрофии тоже преобладает, однако ее доля меньше (р<0,05). Симметричная ГЛЖ выявлена у 5,7% больных ГКМП и у 40,5% - ГБ+ГЛЖ (р<0,05) (рис 1).

Таблица 1. Сравнительная характеристика пациентов с ГЛЖ различной этиологии

	ГКМП	ГБ+ГЛЖ n=37	р ГКМП - ГБ+ГЛЖ
Всего n= 35	без АГ n=19	+ АГ n=16	p ГКМП без АГ - +АГ
Возраст, лет	45,4±15,9	40,9±19,3	49,8±10,2	<0,025	58,6±10,9	<0,005
Продолжительность заболевания, лет	13,1±13,2	11,4±10,4	14,8±15,5	нд.	7,1±6,9	нд.
САД мм рт. ст.	123,4±19,7	108,7±9,3	136,5±16,5	<0,001	151,2±26,6	<0,005
ДАД мм рт. ст.	78,8±12,1	70,0±8,6	86,5±9,3	<0,01	91,2±14,9	<0,025
Стенокардия, ф. к.	0,3±0,7	0,2±0,5	0,4±0,9	нд.	0,9±1,2	нд.
ФК ХСН	1,4±0,	1,0±0,9	1,8±0,7	0,03	1,8±0,5	нд.
Синкопе, %	17,1	16,7	15,6	нд.	15,1	нд.
Пароксизм. МА, %	11,4	5,5	17,6	нд.	9,1	нд.
Постоянная МА, %	5,7	5,5	5,9	нд.	9,1	нд.
Индекс Соколова – Лайона, мм	30,8±17,6	26,2±16,5	35,4±18,2	<0,025	39,2±16,5	нд.
Депрессия ST, мм	1,6±0,5	1,4±1,5	1,3±1,5	нд.	2,0±0,3	нд.
SDNN, мс	134,1±30,4	139,0±39,2	128,9±19,9	нд.	131,9±63,1	нд.
ЖТ, % больных	24,3	15,8	31,2	нд.	31,4	нд.

Рис. 1 Формы ГЛЖ при ГКМП и ГБ