2. Ультраструктура сперматозоидов с вирусоподобными инородными включениями
Проводили ультраструктурное исследование сперматозоидов из образцов эякулята 19 пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности и у которых у которых с помощью реакции иммунофлюоресценции выявлены белки вируса простого герпеса и/или обнаружена инфекционная активность вируса простого герпеса с помощью быстрого культурального метода. В сперматозоидах 13 образцов выявили структуры, имеющие вид двухконтурных мембранных пузырьков с диаметром внешнего контура 120-140 нм и диаметром внутреннего контура 90-110 нм. Сердцевина этих структур по электронной плотности не отличалась от пространства между наружной и внутренней мембранами. У части пузырьков прослеживалась гексагональная структура наружного листка. На основании сравнения морфологических данных было сделано заключение о том, что в сперматозоидах выявляются капсиды вирусов группы герпеса.
Возникает вопрос, почему в сперматозоидах наблюдается только одна форма капсидов – двухконтурные структуры с электронно-прозрачной сердцевиной, то есть, почему не происходит инкапсуляция ДНК? Было предположено, что капсиды в цитоплазматической капле сперматозоидов наблюдаются тогда, когда прекращение ядерно-цитоплазматического транспорта совпадает с синтезом и накоплением в цитоплазме поздних структурных белков вируса, формирующих капсид (2001). Эти белки не могут попасть в ядро, где они должны сформировать капсиды, в которые инкапсулируется ДНК. Если конденсация хроматина совпадает с ранними стадиями жизненного цикла вируса, оформленные герпетические капсиды не выявляются при электронно-микроскопическом изучении, хотя вирусные белки (обнаруживаемые с помощью реакции иммунофлюоресценции) присутствуют.
В настоящей работе показано, что капсиды вируса простого герпеса могут быть обнаружены в ядрах сперматозоидов, наблюдали капсиды в перинуклеарном пространстве ядер и в районе пор ядерной оболочки. Эти данные позволяют считать, что капсиды формируются в ядрах сперматозоидов. Возможно, капсиды в ядрах не выявляются из-за плотности конденсированного хроматина.
3. Идентификация вирусной природы инородных включений в сперматозоидах человека
3.1. Выявление белков вируса простого герпеса с помощью реакции иммунофлюоресценции
Реакцию иммунофлюоресценции проводили с использованием моноклональных антител к сверхранним (МКА 4а – моноклональные антитела к белкам капсида c м. м.32 кД, который появляется в ядре через 45 мин после инфицирования, предположительно α), ранним (МКА 3е5 – появляется в ядре через 1,5 час после инфицирования, предположительно β) и поздним (МКА 2С – поверхностный gB, появляется через 4 час после инфицирования в цитоплазме, предположительно γ) белкам вируса простого герпеса. Антигены вируса простого герпеса визуализировались в виде зеленого свечения в головках сперматозоидов.
В этой серии экспериментов исследовали 101 образец эякулята. Из них для спермиологического обследования после лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта различной этиологии (хламидиоз, уреаплазмоз, гонорея) обратились 22 пациента (1-ая группа), 25 пациентов (2-ая группа) проходили спермиологическое обследование по поводу бесплодия, 34 пациента (3-я группа) проходили профилактическое обследование при планировании беременности жены, у 20 пациентов (4-ая группа) в анамнезе жены имелось спонтанное прерывание беременности (табл. 1).
Таблица 1
Выявление белков вируса простого герпеса с помощью
реакции иммунофлюоресценции
№ группы | Причина обращения | Количество пациентов | Выявлены 3 белка абс.(%) | Выявлены 1 или 2 белка абс.(%) | Не выявлены белки абс.(%) |
1 | После лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта | 22 | 9 (41) | 6 (27) | 7(32) |
2 | Бесплодие | 25 | 10 (40) | 7 (28) | 8 (32) |
3 | Профилактическое обследование | 34 | 9 (26) | 12 (35) | 13 (39) |
4 | Спонтанное прерывание беременности у жены | 20 | 10 (50) | 5 (25) | 5 (25) |
Всего: | 101 | 38 | 30 | 33 |
В 1-ой группе пациентов все три вирусных белка выявлена у 9 человек (41%), во 2-ой группе – у 10 человек (40%), в 3-ей группе – у 9 человек (26%), в 4-ой группе – у 10 человек (50%) (рис. 3). Один или два белка в различных сочетаниях выявлены в 1-ой группе у 6 человек (27%), во 2-ой группе у 7 человек (28%), в 3-ей группе у 12 человек (35%), в 4-ой группе – у 4 человек (25%). Вирусные белки не выявлены в 1-ой группе у 7 пациентов (32%), во 2-ой группе – у 8 пациентов (32%), в 3-ей группе – у 13 человек (38%), в 4-ой группе – у 4 человек (25%).
Таким образом, в сперматозоидах могут быть обнаружены как белки всех стадий жизненного цикла вируса простого герпеса (сверхранние, ранние и поздние), так и белки одной или двух стадий жизненного цикла в различных сочетаниях (абортивная форма инфекции).
3.2. Выявление инфекционной активности вируса простого герпеса в эякуляте пациентов
Выявление инфекционной активности вируса простого герпеса проводили с помощью быстрого культурального метода в цельном эякуляте, семенной плазме и общей клеточной фракции эякулята 101 пациента, у которых проводили выявление сверхранних, ранних и поздних белков вируса простого герпеса.
Все три белка выявлены у 38 пациентов. Положительные результаты быстрого культурального метода в этой группе обнаружены у 31 человека (82%). Общая клеточная фракция исследована с помощью быстрого культурального метода у 29 человек, инфекционная активность выявлена у%).
Неполная экспрессия вирусных белков выявлена у 30 человек. Только сверхранние белки обнаружены у 7 пациентов (23%), сверхранние и ранние – у 9 (30%), сверхранние и поздние – у 2 (7%). Поздние белки выявлены у 8 человек (27%), ранние и поздние – у 4 (13%). Всего сверхранние белки выявлены у 18 человек (60%), ранние – у%), поздние – у%). При неполном наборе вирусных белков положительные результаты быстрого культурального метода наблюдали у 15 пациентов (50%), при анализе общей клеточной фракции выявлена инфекционная активность вируса у 5 человек (17 %).
Вирусные белки не обнаружены у 33 пациентов. Положительные результаты быстрого культурального метода наблюдали у 5 пациентов (15%), инфекционная активность вирусов выявлена в общей клеточной фракции у 3 пациентов (9%) (рис. 4).
Рис. 3. Выявление белков вируса простого герпеса в сперматозоидах с помощью реакции иммунофлюоресценции (в процентах).
1-ая группа – пациенты с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта в анамнезе; 2-ая группа – пациенты с нарушениями фертильности; 3-я группа – пациенты, проходившие профилактическое обследование; 4-ая группа – пациенты, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности.
1 – выявление α, β и γ белков вируса простого герпеса; 2 – выявление одного или двух белков; 3 – не выявлены вирусные белки
Рис. 4. Определение инфекционной активности вируса простого герпеса в эякуляте пациентов с выявленными α, β и γ вирусными белками в сперматозоидах (1-ая группа), пациентов, у которых выявлены один или два белка (2-ая группа), пациентов с отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции (3-я группа)(%).
1 – общие положительные результаты быстрого культурального метода, 2 – положительные результаты быстрого культурального метода в общей клеточной фракции.
Таким образом, инфекционная активность вируса простого герпеса определялась статистически значимо чаще в тех образцах эякулята, в которых выявляли белки всех стадий жизненного цикла вируса (α, β и γ белки), чем в образцах с наличием одного или двух белков (p=0, 009).
3.3. Выявление белков вируса простого герпеса и инфекционной активности вируса в подвижной фракции сперматозоидов
Фракцию подвижных сперматозоидов исследовали в 39 образцах. Распределение по группам было следующим: основное количество образцов эякулята было от пациентов, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности (20 образцов), 10 образцов от пациентов с нарушением фертильности, 4 – от пациентов с воспалительными заболеваниями в анамнезе и 5 – от лиц, проходивших профилактическое обследование. Во всех 15 образцах эякулята с отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции в общей клеточной фракции белки вируса простого герпеса не обнаружены и во фракции подвижных сперматозоидов.
Положительные результаты реакции иммунофлюоресценции при исследовании фракции подвижных сперматозоидов получили в 19 образцах: белки трех стадий жизненного цикла вируса обнаружили в 8 образцах (21%), белки одной или 2 стадий – в 11 образцах (28%). Инфекционная активность вируса простого герпеса выявлена в 4 исследованных образцах фракции подвижных сперматозоидов.
Таким образом, показано, что во фракции подвижных сперматозоидов могут быть обнаружены либо белки всех фаз жизненного цикла вируса простого герпеса, либо 1 или 2 белка в различных сочетаниях. Инфекционная активность вируса во фракции подвижных сперматозоидов определяется в 3,5 реже, чем белки вируса.
3.4. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридизации in situ
С помощью метода гибридизации in situ с зондами к ДНК вируса простого герпеса было изучено 37 препаратов от 29 пациентов. У 8 пациентов исследовали общую клеточную фракцию и фракцию подвижных сперматозоидов – результаты, полученные методом гибридизации in situ, совпадали (в образцах от 6 пациентов метка была выявлена, а у 2 – не визуализировалась). У 17 пациентов исследовали только общую клеточную фракцию, у 4 – только подвижные сперматозоиды. Контролем служили клетки неинфицированные VERO и инфицированные референс штаммом F1 вируса простого герпеса в концентрации 0,001БОЕ/клетку. При исследовании сперматозоидов выявляли метку в виде локальных темно-коричневых гранул в головках сперматозоидов. Гранулы имели различный размер и были обнаружены как в сперматозоидах с аморфной формой головок, так и в сперматозоидах нормальной морфологии.
Методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса была обнаружена в 21 образце (13 образцов общей клеточной фракции и 8 образцов подвижных сперматозоидов) от 15 пациентов (табл. 2).
Метка была обнаружена в 7 образцах общей клеточной фракции сперматозоидов, в которых выявляли белки всех стадий жизненного цикла вируса (α, β и γ белки) и выявлена инфекционная активность вируса, и в 1 образце с положительными результатами быстрого культурального метода и отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции.
В 3 образцах общей клеточной фракции положительные результаты гибридизации in situ совпадали с положительными результатами реакции иммунофлюоресценции (выявление α, β и γ белков), но инфекционной активности вируса простого герпеса не обнаружена ни в одной из фракций образца. В 3 образцах положительные результаты гибридизации in situ получены при выявлении α, β и γ белков вируса при отрицательных результатах быстрого культурального метода в исследуемой фракции (инфекционную активность вируса выявляли в цельном эякуляте или спермоплазме).
Таблица 2
Выявление ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ
Исследуемые фракции | ГИС (+) | ГИС (–) | ||||||
БКМ (+) в исследуемой фракции | БКМ (–) во всех фракциях | БКМ (–) в исследуемой фракции | БКМ (–) | |||||
РИФ (+)* | РИФ (+/–)** | РИФ (–) | РИФ (+) | РИФ (+/–) | РИФ (+) | РИФ (+/–)* | РИФ (–) | |
Общая клеточная фракция | 7 | 1 | 3 | 3 | 7 | 5 | ||
Фракция подвижных сперматозоидов | 2 | 2 | 1 | 2 | 4 |
Примечания:
РИФ – реакция иммунофлюоресценции,
ГИС – гибридизация in situ.
* приводятся данные по результатам реакции иммунофлюоресценции в исследуемой фракции.
* * с помощью реакции иммунофлюоресценции обнаружены один или два белка в различных сочетаниях.
Исследование фракции подвижных сперматозоидов позволило выявить метку в 4 образцах с полным набором вирусных белков. В 2 образцах инфекционная активность вируса простого герпеса выявлена в исследуемой фракции, в 2 – в цельном эякуляте и спермоплазме, но не выявлена в исследуемой фракции. При неполном наборе вирусных белков во фракции подвижных сперматозоидов положительные результаты гибридизации in situ выявлены в 3 образцах. В 2 из них выявлена инфекционная активность вируса простого герпеса, в 1 инфекционная активность вируса не обнаружена ни в одной из фракций. Вобразцов общей клеточной фракции и 4 образца фракции подвижных сперматозоидов) препаратах от 14 пациентов ДНК вируса не визуализировалась.
Результаты гибридизации in situ были отрицательными при анализе 7 образцов общей клеточной фракции и 4 образцов фракции подвижных сперматозоидов, в которых были выявлены один или два белка вируса простого герпеса. Ни в одном случае не была показана инфекционная активность вируса в исследуемой фракции сперматозоидов. Не отмечено также ни одного случая визуализации метки у 5 пациентов, результаты обследования которых с помощью реакции иммунофлюоресценции и быстрого культурального метода во всех фракциях были отрицательными.
Таким образом, при исследовании сперматозоидов методом гибридизации in situ показано наличие ДНК вируса простого герпеса в головках сперматозоидов у пациентов как с положительными, так и отрицательными результатами выявления инфекционной активности с помощью быстрого культурального метода. Выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса в головах сперматозоидов нормальной морфологии. Выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса во фракции подвижных сперматозоидов. Не выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса ни в одном из образцов, в которых не обнаружено ни белков вируса, ни инфекционной активности.
4. Особенности сперматогенеза у пациентов, в эякуляте которых выявлено герпетическое инфицирование
4.1. Спермиологическое обследование пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов
Исследование проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 1992, 2000). В настоящей работе не найдено статистически значимых различий по показателям спермиологического исследования между группой пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, выявленным с помощью реакции иммунофлюоресценции и/или быстрого культурального метода, и группой пациентов, в сперматозоидах которых герпетическое инфицирование не определено.
Kotronias D., Kapranos N. (1998) продемонстрировали наличие ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридизации in situ. В своей работе авторы подчеркивают связь между наличием ДНК вируса в сперматозоидах и выраженной олигоспермией у пациентов с проблемами фертильности. Позднее теми же авторами (Kapranos N. et al., 2003) в цельном эякуляте пациентов с проблемами фертильности методом гнездовой ПЦР проводилась детекция ДНК вирусов группы герпеса. ДНК вируса простого герпеса обнаружена в 56 образцах эякулята из %), вирус Эпштейна-Барр – в%), цитомегаловирус – в 8 (7%). Выявление вируса простого герпеса коррелировало с малым объемом эякулята и низкой подвижностью сперматозоидов, в отличие от цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр. Этим же методом El Borai N. и соавт. (1997) исследовали цельный эякулят 154 инфертильных и 24 фертильных мужчин. В группе инфертильных пациентов ДНК вируса простого герпеса обнаружена в%) образцах, в контроле вирусы герпеса не обнаружены. Причиной расхождения результатов, полученных в процитированных работах, и результатов данного исследовании, является принцип отбора групп пациентов – из настоящего исследования были исключены пациенты с олигозооспермией.
4.2. Детекция X, Y и 1 хромосом методом FISH в сперматозоидах пациентов с выявленным герпетическим инфицированием
Изучен материал от 17 пациентов, в сперматозоидах которых выявлены белки вируса простого герпеса и/или инфекционная активность вируса. Исследование проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для хромосом 1, X и Y. Выбор ДНК-зондов определялся тем, что при мейотическом делении у человека чаще всего наблюдается нерасхождение хромосом X и Y (Martin R., 2003), в тоже время имеются сообщения о том, при герпетическом инфицировании клеток повреждения затрагивают хромосому 1 (Peat D., Stanley M., 1986).
Показано, что частота полиплоидии по хромосомам 1, Х и Y у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами составляет 0,2±0,1%, анеуплоидии по хромосомам 1, Х и Y – 0,09±0,06, 0,06±0,04, 0,05±0,03% соответственно, частота анеуплоидии ХY – 0,1±0,11%. Определяли также долю общего количества численных хромосомных аномалий в каждом образце. В целом у пациентов с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов в данной группе частоту всех изученных дисомий выявили в 0,48±0,09% ядер клеток.
По данным Chevret E. и соавт. (1994), полученным с помощью двухцветового метода FISH, частота X - и Y-несущих сперматозоидов составляет 49,3% и 49,22% соответственно (соотношение – 1:1), частота XY несущих сперматозоидов достигает 0,42. Используя метод FISH, Van Hummelen P. et al. (1996) продемонстрировали, что нерасхождение хромосом в сперматозоидах здоровых доноров эякулята достигает 1-2%. Показано, что анеуплоидии аутосом встречаются в зрелых половых клетках в пределах 0,05-0,28% (Pellestor F. et al., 1996). Результаты, полученные в данной работе, согласуются с вышеперечисленными данными. Таким образом, частота выявленных нарушений при герпетическом инфицировании сперматозоидов не выше той, которая была обнаружена у здоровых половозрелых мужчин с нормозооспермией (Chevret E. et al., 1994; Pellestor F. et al., 1996; Van Hummelen P. et al. 1996; Shi Q., Martin R., 2000; Martin R., 2003).
4.3. Исследование количественного состава незрелых половых клеток в эякуляте пациентов, в сперматозоидах которых выявлено герпетическое инфицирование
Изучение состояния сперматогенеза проводилось на суховоздушных препаратах ядер половых клеток из суспензии эякулята после окрашивания красителем по Романовскому-Гимза. Подсчитывали ядра клеток на разных стадиях их развития, определяя долю (в процентах) клеток в каждой стадии от общего числа подсчитанных незрелых половых клеток ( и соавт., 1993; 1995; 1997; , 2007).
Было проведено исследование эякулята 24 пациентов, у которых в сперматозоидах выявлены белки вируса простого герпеса. Контрольная группа состояла из 23 мужчин, проходивших обследование в качестве доноров спермы ( и соавт., 1995).
Результаты количественного анализа состава незрелых половых клеток эякулята пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами представлены на рис. 5.
Было установлено статистически значимое (р<0,001) увеличение содержания общей фракции незрелых половых клеток у 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами по сравнению с их содержанием в эякуляте 23 доноров спермы. Индекс незрелых половых клеток в этих группах составлял у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами – медиана 5,75% (минимум=0,00%, интерквартильный размах от 1,85 до 15,20%, максимум=18%), а у доноров – медиана 2,10% (минимум=0,50%, интерквартильный размах от 1,8 до 2,9%, максимум=3,5%) от общего количества подсчитанных половых клеток соответственно. В обследуемой группе обнаружено статистически значимое (р<0,001) увеличение числа клеток, находившихся на стадиях прелептотены, лептотены и зиготены (медиана 1,65% (минимум=0,80%, интерквартильный размах от 1,45 до 2,25%, максимум=3,80%) по сравнению с таковым у доноров спермы (медиана 0,70% (минимум=0,40%, интерквартильный размах от 0,50 до 0,80%, максимум=0,90%). В то же время доли клеток, находившихся в последующих стадиях сперматогенеза, оказались статистически значимо меньшими, чем у доноров. На стадии пахитены этот показатель у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами был – медиана 0,00% (минимум=0,020%, интерквартильный размах от 0,00 до 0,14%, максимум=0,4%), против аналогичного показателя у доноров – медиана 0,40% (минимум=0,20%, интерквартильный размах от 0,40 до 0,60%, максимум=0,8%) (р<0,001). На стадии диплотены у пациентов обследуемой группы – медиана 0,20% (минимум=0,00%, интерквартильный размах от 0,05 до 0,35%, максимум=1,1%), у доноров – медиана 1,00% (минимум=00,00%, интерквартильный размах от 0,40 до 2,00%, максимум=3,00%); p<0,001. Эти отклонения нашли свое отражение в количественных показателях последующих стадий сперматогенеза: наблюдали отсутствие сперматоцитов в метафазе М I и М II, в отличие от доноров (медиана 0,04% (минимум=0%, интерквартильный размах от 0,03 до 0,05%, максимум=0,08%). Количество сперматоцитов II и сперматид (медиана 87,75% (минимум=78,00%, интерквартильный размах от 82,25 до 90,00%, максимум=100,00%)) у пациентов с вирусинфицированыыми сперматозоидами было также статистически значимо меньшим (p<0,001), чем у фертильных мужчин (медиана 92,00% (минимум=86,00%, интерквартильный размах от 90,00 до 93,00%, максимум=96,00%)). Нарушение сперматогенеза выразилось также в статистически значимом (p<0,001) повышении в эякуляте у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами концентрации неидентифицируемых клеток, которые имеют патологически измененную морфологию и представляют собой дегенерирующие половые клетки (медиана 10,10% (минимум=0%, интерквартильный размах от 7,60 до 14,80%, максимум=19,00%)). У доноров этот показатель составлял медиана 5,00% (минимум=2,00%, интерквартильный размах от 4,00 до 80%, максимум=12,00%).
При подсчете неразошедшихся сперматид показано, что средние значения этого параметра для доноров спермы (медиана 23,30% (минимум=9,00%, интерквартильный размах от 18,00 до 28,00%, максимум=36,00%) и для обследуемых лиц (медиана – 22,25% (минимум=0%, интерквартильный размах от 17,30 до 28,25%, максимум=34,00%)) не различались статистически значимо (p=0,744). У пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами возрастает количество неидентифицированных половых клеток, что свидетельствует об интенсивных дегенеративных процессах среди незрелых половых клеток.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
