Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии (стр. 1 )

На правах рукописи

БОЧАРОВА Елена Николаевна

Морфологическая и молекулярно-биологическая

характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва, 2008

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вирусологии РАМН им.

Научный консультант:

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущее учреждение:

ГУ Московский государственный медико-стоматологический

университет

Защита диссертации состоится « » декабря 2008 года в 14-00 часов

на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) ГУ НИИ морфологии

человека РАМН Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии

человека РАМН

Автореферат разослан « » 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несколько десятилетий назад исследователи стали обращать внимание на роль в этиологии бесплодия человека так называемого мужского фактора По сообщениям из различных источников, примерно в 30% случаев бесплодие супружеских пар обусловлено суб - или инфертильностью супруга. Сравнительный анализ многочисленных данных по показателям спермиологического обследования мужчин, выполненных в 23 странах, показал, что за последние 50 лет уменьшение количества сперматозоидов у населения Европы и Северной Америки составило примерно 50% и представляет собой глобальную проблему (Carlsen E., 1992; Swan et al., 2000). Было показано существенное уменьшение концентрации сперматозоидов (с 113 до 66 млн/мл) и объема эякулята (с 3,4 до 2,75 мл) в период с 1938 по 1990 г. г. Исследование Парижского банка спермы показало, что ежегодно концентрация сперматозоидов у доноров уменьшается на 2,6%, подвижность – на 0,3%, содержание морфологически нормальных сперматозоидов – на 0,7% (Auger J. et al., 1995). По данным , (2002) в Москве из 1000 мужчин около 10% имеют подвижность сперматозоидов, соответствующую нормативам ВОЗ (WHO, 1992, 2000). При этом около 30% всех случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, то есть бесплодию с невыясненной этиологией.

В информационном письме МЗ РФ от 01.01.01 г. «Современные технологии в сохранении и восстановлении репродуктивной функции» приводятся данные о том, что, согласно данным эпидемиологических исследований, частота бесплодных пар колеблется от 8 до 15%, а в ряде регионов Российской Федерации имеет тенденцию к увеличению. Таким образом, проблема фертильности является одной из актуальных проблем гинекологии и андрологии.

Основным методом первичной диагностики мужского бесплодия является традиционный метод спермиологического обследования, позволяющий поставить предварительный диагноз и наметить пути дальнейшего обследования больных. Определение количества сперматозоидов, характеристика их подвижности и морфологических свойств дает общие представления об оплодотворяющей способности спермы (Menkveld R. et al., 2001). В последние годы предложены компьютерные методы анализа репродуктивной ценности параметров спермограммы ( и соавт., 2006; Calamera J. et al., 1994; Kruger T. et al., 1995; Hofman G. et al., 1996). В случаях так называемого «идиопатического» нарушения фертильности инструкция ВОЗ (WHO, 1992, 2000) рекомендует проведение функциональных тестов, позволяющих выяснить механизмы аномалий сперматозоидов. Метод количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов человека позволяет выявлять первичный или вторичный характер нарушения фертильности, связь нарушения фертильности с генетическими аномалиями либо с действием экзогенных факторов. На основании ретроспективного анализа результатов электронно-микроскопических исследований сперматозоидов большой группы фертильных мужчин (Bartoov B. et al., 1994; Bacetti B. et al., 2002) получены количественные данные о том, какие аномалии сперматозоидов совместимы с фертильностью.

Имеются сведения о выделении вируса простого герпеса из материала спонтанно абортированных плодов человека и животных (Sifakis S. et al., 1998; Rappersberger K., 1999; Mukaiya R. et al., 2000; Spano L. et al., 2002; Moore D. et al., 2003), причем инфицирование эмбриона при спонтанных абортах может быть значимо выше частоты инфицирования матери, что позволяет думать о негативном влиянии на течение беременности каких-либо других факторов помимо генитального герпеса матери ( и соавт., 2004). О роли мужского фактора в аномальном течении беременности при генитальном герпесе опубликованы единичные работы. Морфология сперматозоидов была подробно описана в классических работах 70-х годов прошлого столетия (Fawcett D. et al., 1971; Fawcett D., 1975). Однако в последние годы появляются публикации, содержащие сведения о новых деталях структуры мужских половых клеток, не описанных ранее. (2001) обнаружила в цитоплазматической капле сперматозоидов структуры, идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса и предположила, что такие сперматозоиды могут содержать вирусную ДНК. Было высказано предположение о роли подобных атипичных сперматозоидов в развитии аномальной беременности человека. Однако до настоящего времени отсутствовали доказательства вирусной природы обнаруженных включений. Не была выяснена роль сперматозоидов, содержащих инородные включения, в развитии патологических процессов репродуктивной системы мужчин и женщин.

Цель работы: выявить ультраструктурные, иммунохимические и молекулярно-биологические изменения сперматозоидов при идиопатическом нарушении фертильности, а также доказать наличие внутриклеточного герпетического инфицирования мужских гамет при некоторых формах нарушения репродуктивного здоровья.

Задачи:

провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов у пациентов при различных видах патоспермии (астенозооспермия, тератозооспермия, глобулозооспермия);

провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с идиопатическим бесплодием, результаты традиционного спермиологического обследования которых соответствуют нормативным показателям;

установить природу инородных вирусоподобных включений в сперматозоидах морфологическими, вирусологическими и молекулярно-биологическими методами;

исследовать цитологические закономерности спермограммы пациентов, в эякуляте которых содержатся инфицированные вирусом сперматозоиды;

выявить сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса, в подвижной фракции эякулята;

провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов из эякулята пациентов, у которых обнаруживали внутригаметное герпетическое инфицирование;

определить частоту анеуплоидий хромосом 1, X и Y в половых клетках эякулята пациентов, у которых обнаруживали сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса;

изучить особенности сперматогенеза с помощью метода количественного анализа незрелых половых клеток эякулята у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами.

Научная новизна

Описан новый тип синдромной патоспермии, при котором выявлена следующая совокупность симптомов: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии, тотальное нарушение ультраструктуры центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью ИКСИ (ICSI, интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов – intracytoplasmic sperm injection) эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.

Методом количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией выявлены множественные аномалии микротрубочек аксонемы, не носящие синдромного характера.

Методом количественного электронно-микроскопического анализа в эякуляте пациента с идиопатическим бесплодием выявлены множественные аномалии постакросомальной зоны головки сперматозоидов.

Впервые инородные вирусоподобные включения, содержащиеся в сперматозоидах и идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены в кариоплазме ядер сперматозоидов, в перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки. Установлено, что в подвижных сперматозоидах могут выявляться белки всех стадий жизненного цикла вируса простого герпеса (сверхранние, ранние и поздние белки), либо белки одной или двух стадий жизненного цикла.

Впервые методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии. Методом гибридизации in situ установлено, что вирусная ДНК может присутствовать в сперматозоидах как при выявлении белков всех стадий жизненного цикла вируса (α, β и γ), так и при выявлении белков одной или двух стадий, то есть при абортивной форме инфекции. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии позволяет сделать заключение о возможности оплодотворения инфицированными сперматозоидами.

Методом количественного анализа незрелых половых клеток эякулята выявлен выраженный цитопатический эффект, обусловленный присутствием сперматозоидов, содержащих вирус простого герпеса. Изменение количественного состава незрелых половых клеток свидетельствует о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.

Впервые показано, что сперматозоиды с включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены у 68% пациентов, у жен которых в анамнезе отмечено невынашивание беременности. В группе пациентов, у которых вирус простого герпеса выявлен вирусологическими методами, но в анамнезе жен не имелось прерывания беременности, сперматозоиды с вирусными капсидами не обнаружены.

Практическая значимость работы

В эякуляте пациентов с идиопатическим бесплодием с помощью метода количественного электронно-микроскопического исследования половых клеток обнаружены нарушения структуры сперматозоидов, не выявляемые с помощью традиционного спермиологического обследования (повышенное содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином, аномалии акросомы и постакросомальной зоны).

Показано, что причиной идиопатического бесплодия и неудач применения метода репродуктивной технологии могут быть аномалии строения центриоли сперматозоидов.

Установлена герпетическая природа инородных вирусоподобных включений в сперматозоидах человека. Показано, что подвижные сперматозоиды нормальной морфологии могут содержать ДНК вируса простого герпеса, что создает риск вертикальной передачи вируса.

Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов, в эякуляте которых выявлены сперматозоиды, содержащие вирус простого герпеса, свидетельствует о том, что селекция поврежденных при инфицировании клеток происходит на стадии сперматогенеза. Показатели традиционного спермиологического обследования не позволяют сделать заключение о наличии внутригаметного герпетического инфицирования.

Показана взаимосвязь наличия у пациентов сперматозоидов с инородными вирусоподобными включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, и анамнеза жен этих пациентов, у которых регистрировались беременности, не закончившиеся родами.

Полученные данные дают основание рекомендовать проведение количественного электронно-микроскопического исследования и вирусологического исследования половых клеток мужчин при патоспермии, при идиопатическом бесплодии, при использовании репродуктивных технологий и при аномалиях беременности в анамнезе у жен пациентов.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может применяться для выявления ультраструктурных нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с патоспермией и для оценки функционального состояния сперматозоидов у пациентов с идиопатическим бесплодием и у пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности. Применение электронно-микроскопического исследования позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, идентифицировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии у пациентов с патоспермией и при идиопатическом нарушении фертильности.

2. У пациентов с идиопатическим бесплодием с помощью количественного электронно-микроскопического анализа выявлено повышенное содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином и аномалии акросомы и постакросомальной зоны.

3. Выявлен новый тип синдромной патоспермии, при котором имеется следующая совокупность симптомов: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии, тотальное нарушение ультраструктуры центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка на 2-3 сутки развития эмбрионов, полученных с помощью интрацитоплазматиченской инъекции сперматозоидов.

4. Вирусоподобные инородные включения, содержащиеся в сперматозоидах и идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены в кариоплазме ядер сперматозоидов, в перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки.

5. В подвижных сперматозоидах нормальной морфологии выявлена ДНК вируса простого герпеса. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах с нормальной морфологией позволяет сделать заключение о возможности оплодотворения инфицированными сперматозоидами.

6. Изменение количественного состава незрелых половых клеток, отсутствие анеуплоидии и отсутствие выраженных изменений в параметрах традиционного спермиологического обследования и в параметрах количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов позволяет сделать заключение о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидов с нормальной морфологией.

Внедрение

Результаты исследования сперматозоидов человека при патоспермии и идиопатическом нарушении фертильности; исследование сперматозоидов человека при наличии включений, идентифицированных как капсиды вируса простого герпеса, а также результаты их влияния на фертильность используются в работе лаборатории генетики нарушения репродукции ГУ Медико-генетического научного центра РАМН, а также при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета им. .

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на: 4-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), втором конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва, 2003 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – ХХI век» (г. Саратов, 2004 г.), I-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва 2004 г.), 3-ем, 4-ом и 5-ом Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (г. Москва, 2005, 2006, 2007 г. г.), международной конференции по андрологии (г. Дагомыс, 2006 г.), 1-ом региональном научном форуме «Мать и дитя» (г. Казань, 2007 г.), 4-ой конференции с международным участием «Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.), XVII ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (г. Казань, 2007 г.), I международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (г. Москва, 2008 г). Результаты работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. (май, 2008 г.), межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (сентябрь, 2008 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 32 работы, из них 8 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 2 методические рекомендации.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 80 рисунками, содержит 17 таблиц. Список литературы включает 518 источников (46 отечественных и 472 зарубежных).

Материал и методы исследования

Исследовали материал от 308 пациентов, обратившихся в клинико-лабораторный центр «Пастер», медико-генетический центр РАМН, Центр планирования семьи и репродукции (г. Рязань). Всем пациентам проводили спермиологическое обследование. В дальнейшем были исключены из исследования 27 пациентов, у которых наблюдали выраженную олигоспермию (количество сперматозоидов в менее 5х106 в образце).

Причины обращения в медицинские учреждения пациенты называли следующие: профилактическое обследование – 103 человека, после перенесенных воспалительных заболеваний урогенитального тракта - 96 человек, по поводу нарушения фертильности (первичное бесплодие) – 46, а также невынашивания беременности, неудач экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов или неудач интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов – 36. Возраст пациентов был от 16 до 48 лет. На момент исследования ни у одного из пациентов не наблюдали клинических проявлений генитального герпеса.

Спермиологическое обследование проводили согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992, 2000). Количественный ультраструктурный анализ проводили по следующим параметрам: 1) состояние хроматина, 2) состояние акросомы, 3) наличие цитоплазматической капли на головке, 4) строение митохондрий, 5) строение аксонемы, 6) состояние фибриллярного слоя. Для трансмиссионной электронной микроскопии материал фиксировали раствором глютарового альдегида на какодилатном буфере. Заливку производили в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме UltraCutIII, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе HU11В.

Для ряда исследований (реакции иммунофлюоресценции, быстрого культурального метода, реакции гибридизации in situ) материал разделяли на фракции: цельный эякулят, семенную плазму, общую клеточную фракцию и фракцию подвижных сперматозоидов.

Клетки эякулята пациентов исследовали методом флуоресцентной гибридизации in situ с ДНК-зондами к хромосомам 1, X и Y. по протоколу для трехцветовой флуоресцентной гибридизации (Soloviev I. et al., 1995; 1997; Yurov Y. et al., 1996a, b; 2002) на базе лаборатории цитогенетики (руководитель – профессор ) ГУ Научного центра психического здоровья РАМН.

Количественный анализ состава незрелых половых клеток (, , 1988; , , 1990; и др., 1995; 1997; 2007) проводили в лаборатории генетики нарушения репродукции (руководитель – профессор ) ГУ Медико-генетического научного центра РАМН совместно с ведущим научным сотрудником, к. б.н. . Для каждого образца эякулята подсчитывали не менее 200-300 незрелых половых клеток.

Выявление антигенов вируса простого герпеса проводили с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции. В качестве специфического иммунного реагента использовали моноклональные антитела к индивидуальным белкам вируса простого герпеса, экспрессируемыми на разных стадиях жизненного цикла вируса, полученные и охарактеризованные в лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии РАМН (руководитель – профессор ). В качестве вторых антител использовали кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши, меченые ФИТЦ (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им. РАМН).

Выявление инфекционной активности вирусов в образцах проводили в лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии РАМН (руководитель – профессор ) совместно со старшим научным сотрудником, к. б.н . Инфекционную активность вирусов в образцах эякулята определяли с помощью быстрого культурального метода. При проведении быстрого культурального метода исследуемый материал сокультивировали с клетками VERO в среде Игла-MEM (ПанЭко, Москва) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Окраску моноклональными антителами осуществляли как описано выше.

После выделения ДНК из образцов проводили полимеразную цепную реакцию с «горячим» стартом с помощью тест-системы «АмплиСенс-200 HSV-430» (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, кат. № V-8-200). Эта тест-система позволяет детектировать присутствие ДНК вируса простого герпеса I и II типов по амплификации 430-нуклеотидного фрагмента специфического для него гена gB, кодирующего один из белков оболочки вируса. В качестве положительного контроля использовали продукты амплификации положительного контрольного образца ДНК из тест-системы, а также препарата ДНК, выделенного из суспензии вируса герпеса. В качестве контролей использовали также препараты ДНК, выделенные из культуры клеток, зараженной вирусом герпеса и аналогичной незараженной культуры.

Для выявления ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридидизации in situ использовали зонды и систему детекции производства Enzo Life Sciences, Inc., США. Положительным контролем служили перевиваемые клетки почки зеленой мартышки линии VERO, инфицированные вирусом простого герпеса 1 типа (референс штаммом F) с инфекционной множественностью 0,001 БОЕ/кл. Денатурацию и гибридизацию проводили в гибридайзере «DAKO» (Дания). Визуализацию метки проводили с помощью микроскопа «Leica DMRB»; изображение подвергали компьютерной регистрации и обработке с использованием системы анализа изображения «LeicaQWIN 550 IW» и видеокамеры высокого разрешения «ProgRes 3012». Исследование проведено на базе отделения патологической анатомии (руководитель – профессор, член-корр. РАМН , консультант - ведущий научный сотрудник, д. б.н. ) Московского научно-исследовательского онкологического институт им. Минздравсоцразвития РФ.

Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет компьютерных программ «STATISTICA 6». Гипотезы о нормальном распределении исследуемых признаков проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистическую значимость межгрупповых различий по количественным признакам оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни и по t-критерию для независимых выборок с неравными дисперсиями. Анализ различия частот встречаемости исследуемых признаков в группах пациентов проводили с помощью точного критерия Фишера (двусторонний тест). Статистические гипотезы проверяли при уровне значимости p=0,05. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Степень личного участия автора: спермиологические и ультраструктурные исследования, исследования с помощью реакции иммунофлюоресценции и гибридизации in situ, а также статистическая обработка материала проведены лично автором.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с нарушением фертильности

1.1. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с «синдромной» спермопатологией

В настоящее время описано 5 типов синдромной патологии: первичная цилиарная дискенезия, синдром ацефалических сперматозоидов (аномалия соединительного участка жгутика), дисплазия фибриллярного слоя, глобулоспермия, аномалия митохондрий. При синдромной патоспермии сперматозоиды с какой-либо характерной атипией строения составляют большую (либо тотальную) часть клеток эякулята конкретного пациента, нарушения структуры сперматозоидов носят семейный характер и имеют доказанное (или предположительное) генетическое происхождение. Эта группа немногочисленна, по разным данным – от 0,1% до 2% среди пациентов с нарушением фертильности (Сhemes H., 2000; Dam A., 2007).

При глобулозооспермии наблюдается агенез акросомы, незрелый хроматин и нарушение укладки митохондрий. C 1971 по 2007 были опубликованы данные всего о 99 случаях глобулоспермии (Dam A., 2007). При выполнении данной работы наблюдали одного пациента с подобной патологией.

Дисплазию фибриллярного слоя обнаруживают у 2% инфертильных пациентов. В настоящем исследовании наблюдали одного пациента с дисплазией фибриллярного слоя, у которого в сперматозоидах при отсутствии центральной пары микротрубочек и соответствующих структур (центрального цилиндра и радиальных спиц) не было нарушено строение периферических дуплетов микротрубочек, динеиновых ручек и нексиновых мостиков. Периаксонемный слой состоял из фибрилл диаметром 50 нм, что соответствует толщине фибрилл поперечных колец фибриллярного слоя. На продольных и поперечных срезах не наблюдалось продольных колонн фибриллярного слоя, т. е. выявлялось нарушение взаимного расположения фибрилл, но не изменение структуры самих фибрилл.

Помимо этого в настоящей работе при проведении дифференциальной диагностики генетически обусловленной и функциональной форм патоспермии с помощью количественного электронно-микроскопического исследования были выявлены пациенты с новой формой синдромной патоспермии – нарушением строения центриоли соединительного отдела жгутика. Эта форма патоспермии была выявлена в сперматозоидах 3 пациентов с диагнозом «идиопатическое бесплодие». По результатам светооптического спермиологического исследования этих пациентов было дано заключение «нормозооспермия». Материал был исследован после неудачных попыток ИКСИ, развитие всех полученных эмбрионов прекращалось на 2-3 сутки после инъекции сперматозоидов в яйцеклетку. У жен пациентов патологии репродуктивной системы не выявлено.

Во всех образцах обнаружены сперматозоиды с атипичным строением центриолей соединительного отдела жгутика – нарушение соединения микротрубочек триплетов центриолей. Атипия строения центриоли имела тотальный характер у каждого из обследованных пациентов. Кроме того, найденные аномалии были схожи у всех пациентов. На основании этого можно предположить, что данное нарушение носит «синдромный» характер и имеет генетическую природу.

1.2. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с идиопатическим нарушением фертильности.

Исследовали сперматозоиды 26 пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом – в 18 случаях после естественного зачатия, в 8 случаях – после внутриматочной инсеминации (1-ая группа). В качестве групп сравнения исследовали сперматозоиды 27 инфертильных пациентов (2-ая группа) и 10 пациентов, обратившихся для профилактического обследования (3-я группа). В исследуемые группы были включены пациенты, у которых при спермиологическом обследовании, проводимом согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992; 2000), выявляли нормозооспермию или слабые отклонения от нормативных показателей. Для выбора пациентов с результатами спермиологического обследования, незначительно отличающимися от нормативных, был введен показатель, характеризующий общее количество подвижных сперматозоидов нормальной морфологии – индекс нормальных подвижных сперматозоидов. Индекс вычисляли как произведение объема эякулята (V), концентрации сперматозоидов (C), процентное содержание сперматозоиды с прогрессивной подвижностью (P) и сперматозоидов с типичной морфологией (M). Согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992, 2000), нормативные показатели имеют следующие значения: V=2 мл, С=20 млн/мл, Р=50%, М=30%. В этом случае индекс НПС=2х20х50х30=6х104. В исследуемую группу были включены пациенты, у которых при спермиологическом обследовании индекс нормальных подвижных сперматозоидов≥6х104.

Были получены следующие результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов с гранулярным хроматином: в 1-ой группе пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом – медиана 46% (минимум=10%, интерквартильный размах от 23 до 58%, максимум=85%); во 2-ой группе инфертильных пациентов – медиана 23% (минимум=6%, интерквартильный размах от 13 до 56%, максимум=88%), в 3-ей группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования – медиана 18% (минимум=7%, интерквартильный размах от 15 до 30%, максимум=30%).

Содержание головок с гранулярным хроматином в 1-ой группе было статистически значимо более высоким, чем в группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования (p=0,002). Во 2-ой группе отличие по содержанию головок сперматозоидов с гранулярным хроматином по сравнению с 3-ей группой не было значимым (уровень значимости p=0,216). Различие по содержанию головок с незрелым хроматином у пациентов 1-ой и 2-ой групп также не было значимым (p=0,116).

Проводили анализ различий частоты встречаемости повышенного содержания головок с гранулярным хроматином в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов (рис. 1).

В 1-ой группе повышенное содержание головок сперматозоидов с гранулярным хроматином наблюдали у%) из 26 обследованных, во 2-ой группе – у%) из 27. В 3-ей группе не выявили пациентов с такой патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака выявили различие между первой и второй группами с уровнем значимости p=0,031, между первой и третьей группами – различие с уровнем значимости p=0,002. Между второй и третьей группами пациентов различия не были статистически значимыми (p=0,132).

У фертильных мужчин при ультраструктурном исследовании выявляют не менее 40% головок сперматозоидов, имеющих акросомы, типичного строения. Проводили анализ содержания сперматозоидов с головками, имеющими акросомы типичного строения в образцах эякулята пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом (1-ая группа), инфертильных пациентов (2-ая группа) и лиц, проходивших профилактическое обследование (3-я группа).

Рис. 1. Количество в обследуемых группах пациентов с повышенным содержанием головок сперматозоидов, содержащих гранулярный «незрелый» хроматин. НХ – доля пациентов с повышенным содержанием головок сперматозоидов, содержащих гранулярный «незрелый» хроматин; ЗХ – доля пациентов, у которых содержание головок сперматозоидов, содержащих гранулярный хроматин, не превышает 30%.

Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов, имеющими типичное строение акросомы, образцах от пациентов были следующими: в 1-ой группе – медиана 65% (минимум=10%, интерквартильный размах от 45 до 78%, максимум=92%); во 2-ой группе – медиана 52% (минимум=16%, интерквартильный размах от 35 до 70%, максимум=88%); в 3-ей группе – медиана 73% (минимум=50%, интерквартильный размах от 56 до 80%, максимум=84%).

Содержание головок сперматозоидов, имеющих типичное строение акросомы, не отличалось статистически значимо у пациентов 1-ой и 3-ей групп (p=0,374). В эякуляте пациентов 2-ой группы содержание головок с типичным строением акросомы было статистически значимо ниже, чем в 3-ей группе (p=0,031). Различие по содержанию головок сперматозоидов с типичным строением акросомы в эякуляте пациентов 1-ой и 2-ой групп не было значимым (p=0,134).

Проводили анализ различий частоты сниженного содержания головок с типичным строением акросомы в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов (рис. 2).

Рис. 2. Количество в обследуемых группах пациентов со сниженным содержанием головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения. АА – доля пациентов, в образцах от которых содержание головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, составляет менее 40%; ТА – доля пациентов, у которых содержание головок сперматозоидов имеющих акросому типичного строения, составляет не менее 40%.

В 1-ой группе пациентов у 5 (19%) из 26 обследованных наблюдали сниженное содержание головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, во 2-ой группе – у 8 (29%) из 27. В 3-ей группе не выявили пациентов с подобной патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака статистически значимого различия между первой и третьей группами, а также между первой и второй группами не было выявлено (p=0,294 и p=0,526, соответственно). Между 2-ой и 3-ей группами различия не были статистически значимыми (p=0,079).

Процесс оплодотворения включает в себя взаимодействие сперматозоида и яйцеклетки, слияние клеточных мембран и геномов женской и мужской гамет (Primakoff P., Myles D., 2007). Успешное завершение развития эмбриона, по крайне мере, частично, зависит от целостности и полноценности ДНК сперматозоида (Ahmadi A., Ng S., 1999). Имеется порог повреждений ДНК (к которым относятся фрагментация ДНК, нарушение компактной упаковки ДНК, дефицит протаминов), при котором развитие эмбрионов ухудшается (Ahmadi A., Ng S. C., 1999). Компактизация хроматина происходит во время спермиогенеза, при переходе округлых сперматид в удлиненные, когда имеет место замена основных белков – гистонов, на другие основные белки – протамины (Brewer L. et al., 2002; Dadoune J., 2003). Этот процесс визуализируется как появление и прогрессивное возрастание гранулярного характера хроматина, который достигает плотной, компактной консистенции, в которой индивидуальные гранулы не различаются (Holstein A., Roosen-Runge E., 1981). При нарушениях компактизации хроматина в ядрах головок сперматозоидов выявляются гранулярно-фибриллярные или гранулярные структуры (Baccetti B. et al., 1996; Chemes H., 2000; Muratori M. et al., 2000), повышается чувствительность к повреждающим факторам внешней среды (окисление или повышение температуры в женском генитальном тракте) (Kosower N. et al., 1992).

В ряде исследований показано выраженное различие в содержании сперматозоидов с поврежденной ДНК между группами фертильных и инфертильных мужчин (Gandini L. et al., 2000; Host E. et al., 2000b; Spano M. et al., 2000; Zini A. et al., 2001; Saleh R. et al., 2002; Larson-Cook K. et al., 2003). Степень оплодотворения может быть близка к нулевой, если доля сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 30% клеток как при естественном зачатии (Evenson D. et al., 1999; Spano M. et al., 2000), так и при внутриматочной инсеминации (Duran E. et al., 2002; Saleh R. et al., 2003; Bungum M. et al., 2004).

Имеются единичные сведения о связи между нарушением упаковки хроматина и повреждением ДНК. Положительная корреляция этих показателей показана в сперматозоидах пациентов с идиопатическим бесплодием при нормальных показателях спермиологического обследования (Piasecka M. et al., 2006).

В настоящей работе показана связь между содержанием сперматозоидов с недостаточной компактизацией хроматина у пациентов с нормативным показателями спермиологического обследования и нарушениями фертильности (спонтанное прерывание беременности у жен пациентов). Имеется также связь между нарушением строения акросомы сперматозоидов и другой формой нарушения фертильности – отсутствием зачатия в течение года у пациентов с нормативными показателями спермиологического обследования. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой разработан ряд функциональных тестов (Aitken R., 2006). Низкий результат пенетрационных тестов соответствует низкой степени оплодотворения яйцеклетки. Показано, что нарушение морфологии акросомы более выражено в группе пациентов, у жен которых не происходит зачатия в срок не менее 1 года. Можно высказать предположение, что метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов сравним по результатам с пенетрационными тестами. Метод электронно-микроскопического исследования, таким образом, может быть использован как альтернативный при оценке пенетрационной функции акросомы сперматозоидов.