Общая микробиология (стр. 12 )

Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации /обмена генетической информации/ у бактерий.

У бактерий имеется 2 типа изменчивости: фенотипическая и генотипическая. Фенотипическая изменчивость (модификации)- это изменение внешних признаков, не затрагивающее генотип.

Фенотип - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; фенотип определяется взаимодействием генотипа с условиями окружающей среды.

Генотипическая изменчивость затрагивает не только фенотип но и генотип - совокупность всех генов клетки.

Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются модификации: кратковременные / в пределах одного поколения/ и длительные/ сохраняются в поколениях/.

Отличия длительной модификации от мутации

1.  Отсутствие изменений в структурных генах генотипа;

2.  Приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;

3.  «Затухание» /исчезновение/ признака в ряду поколений.

Примером фенотипической изменчивости бактерий является диссоциация - расщепление признака при изменении условий культивирования: переход форм с гладкими колониями в Р – формы с шероховатыми колониями, потеря пигмента, появление неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т. д.

Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и рекомбинациями. /см. словарь основных терминов/.

Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуцированные известным мутагеном. По локализации различают: а/ генные – затрагивают один ген; б/ хромосомные – затрагивают группу генов; в/ плазмидные – затрагивают гены плазмид.

Механизм мутаций Вам известен. Это: а/ делеция – потеря гена или участка ДНК; б/ дупликация – удвоение генетического фрагмента; в/ транспозиция – изменение положения гена; г/ инверсия – переворот участка ДНК на 180°; д/ вставка нового гена.

Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признака – прямая мутация или к его восстановлению – обратная мутация. Так как у бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.

Вторым механизмом генотипической изменчивости у бактерий являются рекомбинации. - перераспределение генетического материала родителей в потомстве / обмен генетического материала, приводящий к появлению новых сочетаний генов/.

Особенности рекомбинации у бактерии:

1.  Однонаправленность переноса генетической информации /от донора к рецепиенту/;

2.  Неодинаковое долевое участие генома и реципиента в образовании рекомбинанта /реципиентный геном полностью переходит к рекомбинанту, а от донора только отдельные гены, плазмиды/;

3.  В результате рекомбинации образуется мерозигота /частичная зигота/;

4.  Наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация, трасформация, трансдукция, слияние протопластов.

Механизмы рекомбинации:

I.  Конъюгация – перенос генетической информации при непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового процесса у бактерий. Поло у бактерий определяет F – плазмиды: в «мужских» клетках /F+/ она есть, в «женских» /F-/ - отсутствует.

Отличия f+ b f - клеток

1.  У F+ клеток есть дополнительная генетическая информация /F – фактор/;

2.  F+ клетки имеют на поверхности специальные ¦ - пили, обеспечивающие контакт при конъюгации;

3.  F+ клетки имеют дополнительный ¦i – антиген / белок ¦ - пилей/;

4.  F+ и F - клетки отличаются поверхностным зарядом;

5.  F+ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не адсорбируются на F- клетках;

6.  F+ клетки обладают свойствами донора/отдают генетическую информацию/, а F - клетки – свойствами реципиента /воспринимают генетическую информацию/. Как уже указывалось, рецепиентные клетки участвуют в образовании рекомбинанта всем своим геномом, а донор передает свою генетическую информацию лишь частично. Чаще это конъюгативные плазмиды, но H¦r – штаммы /см. словарь основных терминов/ передают с высокой частотой хромосомные гены при коньюгации.

II. Трансдукция – перенос генетической информации от донора к рецепиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трандуцирующий фаг – это умеренный фаг, при который при индукции дизогенной культуры захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них эти гены.

При строгой специфичности локуса интеграция умеренного фага с хромосомой лизогенной клетки /например, для фага l - рядов с lас – опероном, для фага Р – рядов с trp – опероном и т. д./ при индукции захватываются и переносятся всегда строго определенные гены – это специфическая трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом – общая трансдукция. Захват случайных бактериальных геновы может происходить при сборке фагов или в том случае, каогда профаг не имеет строго определенного локуса в геноме бактерий.

Изменение свойств бактерий, инфицированных умеренным фагом, может происходить и под действием генов самого фага – явление фаговой, или лизогенной конверсии.

Отличия трансдукции от фаговой конверсии:

1.  Приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фага.

2.  Частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой конверсии.

III.  Трансформация – передача генетической информации при культивировании реципиента на среде с ДНК донора.

Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдельные фрагменты. Реципиенты клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой воспринять генетическую информацию, обнаруживается особый белок – фактор компетентности. Его действие связывают: а/ с повышением проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, б/ с ингибированием ДНК-аз, в/ с активированием синтеза и рестриктаз. Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Когда она активно строит свою ДНК, то в этот момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются условия для трансформации. In vitro эти условия создают искусственно.

Молекулярно-биологические методы идентификации

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода:

Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при которой происходит лизис клеток с выходом ДНК. Часть материала переносится в пробирку, содержащую смесь мононуклеотидов, ДНК-полимеразу и праймер – уникальную последовательность нуклеотидов, присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры ( 30 циклов) позволяет осуществить репликацию определенного возбудителя. Этот процесс называется амплификацией, в результате которого количество специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК могут быть выявлены с помощью электрофореза в агаровом геле. Преимуществами метода ПЦР являются:

1.  Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека.

2.  Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. Для повышения специфичности возможно определятьнесколько разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma urealyticum можно выявлять как ген 16S-RNA, так и ген уреазы. А для идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной ДНК и ДНК криптической плазмиды сталовозможным выявлять рибосомальную РНК (NASBA). Это значительно повышает достоверность исследования.

3.  Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования.

4.  Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.

5.  Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.

Недостатки метода ПЦР

1.  Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПНР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.

2.  Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно-патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR).

3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей

ДНК зондирование.

Принцип метода: Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов – фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку ( радионуклид, фермент или флюорохром ) . Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо - или типоспецифическими.

Сазернблоттгшг (гибридизация по Сазену) - выявление участка ДНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на мембране фрагментов искомой ДНК с мечеными комплементарными ДНК-зондами. Сначала с помощью гель-электрофореза разделяют фрагменты ДНК. После электрофореза гель переносят в щелочной раствор для получения из двунитевой ДНК однонитевых фрагментов. Затем фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны и гибридизируют со специфической меченой пробой ДНК (комплементарным олигонуклеотидным зондом, меченным радионуклидом или флюо-рохромом). Неспецифически связанные молекулы зонда отмывают­ся, а меченые участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография), на которой проявляются полосы меченого зонда ДНК. Зонды, меченные флюорохромом, вы­являют при помощи люминесцентной микроскопии. Нозернблоттинг применяют для выявления и гибридизации РНК (фрагментов РНК). В этом методе размер и количество специфических молекул и РНК определяются после обработки общей РНК или поли(А)РНК. Молекулы РНК выделяют гель-электрофорезом и переносят на иммобилизованную мембрану. Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой пробой.