Общая микробиология (стр. 6 )

Получение сливного роста можно использовать для накопления полученной культуры. В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с материалом и производят посев зигзагом, двигаясь снизу вверх.

Ко второй группе методов получения чистых культур микроорганизмов относятся:

а) фильтрация. Исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (например, для очистки вирусов от бактерий)

Биологические методы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, при этом подвижные формы микроорганизмов при размножении «выползают» на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris).Отсевая верхний край культуры в воду свежескошенного агара и повторяя эту манипуляцию несколько раз, можно получить чистую культуру.

б) метод прогревания – прогревают материал до 800С на водяной бане 10-15 мин., при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на питательную среду прорастают ( метод позволяет отделить споровые культуры от неспоровых)

в) метод охлаждения – выращивание микроорганизмов при низких температурах. Применяют для выделения чистых культур психрофильных бактерий (микроорганизмы рода Yersinia выращивают при температуре 50 С)

г) бактериостатический метод при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на других (пенициллин задерживает рост Гр+ микроорганизмов, не влияя на ГР-, 5% Н2SO4 убивает большинство микроорганизмов, исключая кислотоустойчивых (возбудитель туберкулеза)

д) метод обогащения посев на элективные среды

е) заражение лабораторных животных.

Методические указания:

Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:

1.Форма колонии

2.Размер колонии

3.Цвет

4.Характер края

5.Характер поверхности

6. Консистенция

Посев по методу Дригальского.

1.Подготовить 3 чашки Петри со стерильной питательной средой.

2. В центр среды петлей вносят 1 каплю исследуемой культуры.

3. Равномерно растирают каплю шпателем по поверхности питательной среды в чашке Петри.

4. Не обжигая шпателя, переносят материал последовательно во вторуюи третью чашки Петри.

На третьей чашке Петри после инкубации должны вырасти изолированные колонии микроорганизмов.

Посев истощающим штрихом.

1.Подготовить чашку Петри со стерильной питательной средой.

2. Разделить чашку Пери на 4 равных квадрата.

3. Посев производят петлей, начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.

Таблица. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Метод выделения чистой культуры	Описание метода	Область применения

Схема бактериологического метода лабораторной диагностики

Исследуемый материал

I этап (нативный материал): Микроскопия.

Посев на среды обогащения или на плотные питательные среды

II этап (изолированные колонии): Изучение культуральных, тинкториальных и морфологических свойств. Посев на скошенный питательный агар для выделение чистой культуры

III этап (чистая культура): Идентификация выделенной культуры.

Заключение о выделенной культуре

Контрольные вопросы:

1.Для чего предназначены питательные среды и каковы основные требования к ним?

2. Какие элективные среды Вам известны? Назовите их состав.

3. Какие методы применяются для выделения чистых культур микроорганизмов?

4. Почему бактериологический метод диагностики является основным при диагностике инфекционных заболеваний?

5. Назовите основную схему бактериологического исследования.

6.Чем определяется длительность бактериологического исследования?

Список литературы:

Обязательная:

1.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2.  , , Рыбакова . М., Медицина. 1998 г.

3.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4.  Борисов к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1.  , Кривошеин . М., 1980 г.

2.  , Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3.  Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 5 Физиология микроорганизмов. Биохимические свойства микроорганизмов.

Цель: Научиться определять чистоту выделенной культуры, делать пересевы петлей, учитывать результаты определения биохимических свойств бактерий.

Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных заболеваний, способы поступления питательных веществ в бактериальную клетку, особенности обмена веществ бактериальной клетки, классификацию и функции ферментов, методы идентификации микроорганизмов.

Уметь: Описывать биохимические свойства бактерий и осуществлять пересевы для получения чистой культуры микроорганизмов и распознавания их биохимических свойств.

Обоснование темы: Изучение биохимических свойств микроорганизмов проводится с целью идентификации микроорганизмов, что является основным звеном в диагностике инфекционных заболеваний

Вопросы для самоподготовки:

1. Пластический и энергетический обмен

2. Питание бактерий Способы поступления питательных веществ в бактериальную клетку. Пермеазы.

2.Ферменты бактериальной клетки.

3. Идентификация и внутривидовое типирование.

4. Способы изучения биохимических свойств бактериальной клетки.

ПЛАН

Программа:

1. Особенности обмена веществ бактериальной клетки.

2. Идентификация бактерий.

3. Изучение биохимических свойств микроорганизмов.

Демонстрация:

1. Незасеянный «пестрый ряд».

2.Варианты изменения «пестрого ряда».

3. Незасеянная и измененная среда Клиглера.

4.Среда Симмонса.

5.СИБы.

6 Микрометод изучения биохимических свойств бактерий. Пластинки для идентификации.

Задание студентам:

1.Изучить состав, назначение и внешний вид сред Гисса. Зарисовать варианты изменения «пестрого ряда». Определить биохимическую активность различных микроорганизмов по средам Гисса.

2. Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить характер роста и присутствие посторонних бактерий.

3.Убедится в чистоте выделенной культуры методом микроскопии окрашенного по Граму мазка.

4. Поставить каталазную пробу на предметном стекле.

5. Учесть результаты определения биохимической активности выделенных чистых культур на среде Клиглера.

6.Осуществить посев материала на скошенный МПА для получения чистой культуры

Информационный материал.

Обмен веществ (метаболизм) - совокупность процессов превращения веществ и энергии, направленных на сохранение и воспроизведение жизни.

Уровень метаболизма микробной клетки выше, чем у других организмов. Обмен веществ объединяет два процесса: пластический обмен (анаболизм, ассимиляция) и энергетический обмен (катаболизм, диссимиляция,).

Пластический обмен – это конструктивный метаболизм, при котором происходят реакции синтеза молекул клетки микроорганизма, обеспечивает усвоение веществ из окружающей среды, используемых для построения клеточных структур. Эта работа требует энергии, которую клетки получают в результате энергетического обмена.

Энергетический обмен – расщепление питательных веществ (белков, углеводов, липидов и др.). Эти процессы могут происходить в аэробных или анаэробных условиях. Катаболизм и анаболизм взаимосвязаны.

У микробной клетки соотношение поверхности к массе очень высоко по сравнению с другими организмами. Микробные клетки обладают огромным набором ферментов.

Биохимическая идентификация.

. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции:

Ферментацию – неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов.

Окисление- полное расщепление субстрата до углекислого газа и воды.

Утилизацию – использование субстрата для роста.

Диссимиляцию субстрата.

Гидролиз субстрата.

Традиционный метод идентификации по биохимическим свойствам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма.

Определение сахаролитической активности.

1. Определение биохимической активности с помощью посева на среды «пестрого ряда». Короткий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гиса с моно - и дисахаридами, глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный «пестрый ряд» кроме перечисленного входят среды с арабинозой, ксилозой, галактозой, глицерином и т. д. Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор Андреде, позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления и «поплавок» для обнаружения газа.

2. Определение биохимической активности на среде Клиглера. Среда Клиглера предназначена для определения ферментации глюкозы, лактозы, выделения сероводорода и выделения газа. Разливается в пробирки и скашивается наполовину. Незасеянная среда Клиглера имеет красный цвет. Если после инкубации скошенная часть среды меняет цвет с красного на желтый, происходит ферментация лактозы, если столбик агара меняет цвет с красного на желтый – происходит ферментация глюкозы. Если в столбике агара наблюдается почернение – выделяется сероводород и происходит ферментация глюкозы. Если в среде наблюдаются пузырьки газа, следовательно в процессе ферментации выделяется газ.

Определение протеолитических свойств микроорганизмов.

Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры на мясо-пептонную желатину, которую инкубируют при комнатной температуре несколько дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин.

При разрушении белков может выделятся аммиак, индол или сероводород.