Общая микробиология (стр. 7 )

Реакция на аммиак. Применяют полоску фильтровальной бумаги пропитанной индикатором. При положительном результате бумага синеет.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий добавляют несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола на поверхности появляется розовое кольцо.

Реакция на сероводород. Можно использовать фильтровальную бумагу с сульфатом железа. При выделении сероводорода бумага окрашивается в черный цвет.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят 1-2 капли раствора пероксида водорода и вносят нее петлю с исследуемой культурой. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии каталазы.

Определение биохимической активности микроорганизмов с использованием Системы индикаторных бумаг (СИБы)

Принцип действия: диски из фильтровальной бумаги, пропитанные питательными средами (питательная среда + субстрат+индикатор) и высушенные, хранятся во флаконах. В лаборатории диски раскладываются в стерильные пробирки и заливаются суспензией исследуемой культуры в физрастворе. Учет проводят после 18-24 часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора.

Определение биохимической активности микроорганизмов с использованием Панелей биохимической идентификации.

Принцип действия: в лунках специальных пластиковых панелей находятся соответствующие высушенные среды (питательная основа+субстрат+индикатор). В лаборатории в лунки вносят суспензию исследуемой культуры и после инкубации (5-24 часа) учитывают результат по изменению цвета индикатора.

Примеры: Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий, панель биохимической дифференцировки стафилококков.

Системы автоматизированной идентификации.

Принцип действия тот же, что и в предыдущем пункте. Но инкубация панелей, учет результатов и идентификация проводятся при помощи компьютера.

Методические указания:

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда".

1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда".

2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше.

3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды;

4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке.

5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом».

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью среды Клиглера

1. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей на среду Клиглера

2. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч.

3. В том случае, если бактерии ферментируют лактозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области скошенной части.

4. В том случае, если бактерии ферментируют глюкозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области «столбика».

5. В том случае, если бактерии выделяют сероводород, наблюдается изменение цвета среды с красного на черный в области «столбика».

6. При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа в толще среды.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.

Контрольные вопросы:

1.Для чего проводится идентификация микроорганизмов?

2. Какие методы идентификации наиболее часто применяются в современных бактериологических лабораториях?

3. Для чего применяется «пестрый ряд» и каков его состав?

4. Что такое протеолитические свойства? Каким образом можно их определить?

5. Что такое СИБы? Для идентификации каких бактерий их применяют?

Список литературы:

Обязательная:

1.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2.  , , Рыбакова . М., Медицина. 1998 г.

3.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4.  Борисов к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1.  , Кривошеин . М., 1980 г.

2.  , Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3.  Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 6 Физиология микроорганизмов. Дыхание микроорганизмов. Анаэробы. Методы культивирования. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Дезинфекция. Стерилизация.

Цель: Изучить принципы создания сред для анаэробов и методы их культивирования, основные методы стерилизации и дезинфекции и оборудование, применяемое для этого.

Знать: Особенности дыхания микроорганизмов, основные методы выделения чистых культур анаэробов, состав питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, способы контроля дезинфекции и стерилизации.

Уметь: Описывать культуральные свойства анаэробных бактерий и уметь выбрать способ дезинфекции и стерилизации в зависимости от свойств объекта.

Обоснование темы: Анаэробы являются возбудителями многих заболеваний, для их диагностики требуются специфические методы культивирования.

Вопросы для самоподготовки:

1.Дыхательные цепи микроорганизмов.

2.Классификация микроорганизмов по типу дыхания.

3.Особенности питательных сред для анаэробов.

4. Создание условий для культивирования анаэробов.

5. Методы выделения чистой культуры анаэробов.

6. Стерилизация и дезинфекция.

7. Контроль качества дезинфекции и стерилизации.

ПЛАН

Программа:

1. Изучение питательных сред для анаэробов: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера, молоко по Тукаеву.

2. Описание культуральных свойств анаэробов.

3. Изучение способов создания анаэробных условий.

4. Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации.

5. Методы дезинфекции.

6. Методы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции.

Демонстрация:

1. Питательные среды – среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера.

2.Варианты роста анаэробов на этих питательных средах.

3. Эксикатор, анаэростат.

4. Аппаратура, применяемая для стерилизации.

Задание студентам:

1. Зарисовать и записать состав и назначение питательных сред: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, молоко по Тукаеву, агар Цейсслера.

2. Описать особенности роста анаэробов на питательных средах.

3. Учесть результаты опытов, поставленных с целью контроля стерилизации. Сделать заключение. Заполнить таблицу: Методы контроля режима стерилизации.

4. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-излучения на стафилококки.

5. Заполнить таблицу: Основные методы дезинфекции и контроля качества дезинфекции.

6. Оценить результаты посева материала на скошенный МПА.

Информационный материал.

Питательные среды для выращивания анаэробов:

Среда Вильсон-Блер (железосульфитный агар) готовиться из питательного агара, к которому добавляется глюкоза, сульфит натрия, хлорид железа (2). Анаэробные клостридии на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия в сульфид, который, соединяясь с хлоридом железа, дает черный осадок.

Среда Китта-Тароцци. Состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла.

Тиогликолевый бульон с гемином (элективная среда для культивирования неспорообразующих анаэробов). Состоит из гемина, гидролизата казеина, глюкозы, цистеина, сульфата натрия, хлорида натрия, тиогликолата натрия.

Сахарно-кровяной агар Цейсслера. Состоит из питательного агара, 1-2 % глюкозы, дефибринированной крови.

Среда Вейнберга. Состоит из питательного агара, печени, фосфата натрия, 0,5 % глюкозы, хлористоводородной кислоты.

Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»—бесплодный)– полное уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование, прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы стерилизации

1. Физические методы. Существуют различные способы стерилизации при помощи высокой температуры

1. Прокаливание на огне - фламбирование (спиртовка) — применяется для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, предметных стекол, пинцетов.

2. Кипячение применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40 минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы.

3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера. Сегодня для этой цели применяются сухожаровые шка­фы различных марок. Простейшая печь Пастера состоит из металлической емкости с двойными стенками, оборудованной термометром для контроля температуры и нагревательным элементом.

Приготовленный соответствующим образом материал ставят в печь и стерилизуют в течение 45 минут при температуре 165—170°. Пробирки, колбы, флаконы закрывают ватными пробками.

4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100—120°.

Различают:

1) стерилизация паром под давлением,

2) стерилизация текучим паром.

Стерилизация паром под давлением — основана на том, что образующийся пар не выходит наружу, а скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. Соответственно давлению повышается и температура кипения воды; при повышении давления на 1 атм. температура кипения будет равна 120°, при повышении давления на 2 атм.— 134,18° и т. д. При такой температуре микро­организмы и их споры погибают очень быстро (при 120° в течение 15—20 минут).