Общая микробиология (стр. 5 )

4.  Промыть водой.

5.  Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.

6.  Промыть водой, высушить.

В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.

Окраска капсул по методу Бурри-Гинса:

1.  Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла сделать мазок.

2.  На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3.  Промыть водой, высушить.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы не окрашиваются и остаются прозрачными на темном фоне туши.

Окраска спор по методу Ожешко:

1.  Протравливание мазка 0,5 % раствором соляной кислоты 2-3 мин при нагревании.

2.  Промыть водой.

3.  Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. В результате окрашивания споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Контрольные вопросы:

1. Какое строение и функции имеет нуклеоид бактериальной клетки?

2. Какое значение в жизни бактерий имеют плазмиды?

3. Каково строение спор бактерий?

4. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Циля-Нильсена, Бурри, Ожешки, Нейссера.

5. С помощью какого метода окраски возможно обнаружить капсулы у бактерий?

Список литературы:

Обязательная:

1.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2.  , , Рыбакова . М., Медицина. 1998 г.

3.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4.  Борисов к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1.  , Кривошеин . М., 1980 г.

2.  , Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3.  Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 4 Физиология микроорганизмов. Бактериологический метод диагностики. питание бактерий. Питательные среды. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Цель: Научиться выделять чистую культуру микроорганизмов, учитывать рост микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных заболеваний, особенности и классификацию питательных сред, особенности питания бактерий.

Уметь: Описывать культуральные свойства микроорганизмов, выделять чистые культуры с помощью механических методов.

Обоснование темы: Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний, для его постановки необходимы сведения о основных питательных потребностях бактерий и условиях их культивирования.

Вопросы для самоподготовки:

1. Особенности бактериологического метода диагностики, его достоинства и недостатки.

2. Питание бактерий. Потребности в питательных веществах.

3.Требования, предъявляемые к питательным средам.

4. Классификация питательных сред.

5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

ПЛАН

Программа:

1. Метаболизм аэробных и анаэробных бактерий.

2. Питательные среды, применяемые для культивирования.

3. Понятие о чистой культуре и методы ее выделения.

Демонстрация:

1. Готовые питательные среды: мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, среда Эндо, желточно-солевой агар, солевой бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева.

2. Техника посева исследуемого материала петлей и шпателем на чашку Петри с плотной питательной средой с целью получения изолированных колоний.

Задание студентам:

1.Ознакомиться с питательными средами, их назначением: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среда Эндо, среда Плоскирева, желточно-солевой агар ЖСА, солевой бульон (СА) селенитовый бульон и основными инградиентами для их изготовления.

2. Описать характер роста микроорганизмов на плотной питательной среде, оценить культуральные свойства бактерий

3.Описать характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах.

4. Выполнить 1 этап выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала и наметить ход дальнейшего исследования. Осуществить посев инокулята по методу Дригальского. Осуществить посев инокулята истощающим штрихом.

6. Заполнить таблицу. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Информационный материал.

Основные среды:

Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде, состоит из триптического гидролизата кильки хлорида натрия.

Питательный агар. Состав: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, агар, хлорид натрия.

Элективные питательные среды.

Желточно-солевой агар. Содержит 8-10% хлорида натрия, который не препятствует росту стафилококков и питательную основу с лецитином, при расщеплении которого вокруг колоний образуется перламутровый венчик преципитата.

Дифферинциально-диагностические среды.

Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.

Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.

Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.

Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный - индикатор на РН.

Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда ЖСА (желточно-солевой агар) - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.

Состав: МПА - питательная основа; 10% NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.

Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.

Требования к питательным средам:

1.  Среды должны быть питательными, т. е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли, факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов.

2.  Среды должны быть изотоничными, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl.

3.  Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности выделения чистой культуры

4.  Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т. к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.

5.  Среды должны обладать определенным ОВП, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих.

6.  Среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом культур.

7.  Среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота, содержание хлоридов, пептона.

Культуральные свойства микроорганизмов – особенности роста микроорганизмов на плотной питательной среде.

Бактериологический метод – основной метод диагностики инфекционных заболеваний. Включает в себя посев исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры и ее идентификацию( посев на плотные питательные среды, на жидкие питательные среды, определение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, свойств, чувствительности к антибиотикам, количества микроорганизмов в исследуемом материале – определение вида и штамма микроорганизма.)

Выделение чистой культуры основа бактериологической работы, т. к. в процессе деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микроорганизмов, а идентификация вида возможна тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

Для получения чистой культуры необходимо отделить клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основных группы методов выделения чистых культур:

1.  Методы, основанные на механическом разделении.

2.  Методы, основанные на различиях в биологических свойствах.

Чаще всего используют механические способы разъединения бактериальных клеток - специальные методы посева.

Техника посева материала на плотную питательную среду.

Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического распределения микробов при посеве. Существует несколько способов посева материала.

Посев по методу Дригальского производится шпателем в чашку Петри на плотную питательную среду. Предварительно в центр среды петлей вносят каплю исследуемой культуры, а затем растирают по всей поверхности с помощью стерильного шпателя.

Посев истощающим штрихом производят петлей, предварительно разделив чашку Пери на 4 равных квадрата. Посев начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.