Общая микробиология (стр. 4 )

Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к грамотрицательным – гонококки, кишечная палочка, менингококки и др. Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от различных внешних и внутренних факторов.

Для правильной окраски следует соблюдать технику окрашивания.

Контрольные вопросы:

1.Назовите основные морфологические формы бактерий.

2 Каково строение клеточной стенки бактериальной клетки?

3.Каковы основные отличительные признаки Гр(-) и Гр(+) микроорганизмов?

4. Каково значение сложных методов окрашивания при диагностике инфекционных заболеваний?

5. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Грама.

таблицу

Структура бактериальной клетки

органоид	функция	Методы выявления

Список литературы:

Обязательная:

1.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2.  , , Рыбакова . М., Медицина. 1998 г.

3.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4.  Борисов к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1.  , Кривошеин . М., 1980 г.

2.  , Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3.  Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 3 Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

Цель: Изучить строение бактериальной клетки, функции и методы выявления отдельных органоидов. Научиться окрашивать мазки по методу Циля-Нильсена, Бурри и Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешко.

Знать: Особенности морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток.

Уметь: Приготовить мазок, окрасить его сложным методом, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.

Обоснование темы: Строение бактериальной клетки имеет важное значение для классификации бактерий и используется для бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных заболеваний

Вопросы для самоподготовки:

1.  Отличительные черты клеток прокариотов от клеток эукариотов.

2.  Облигатные компоненты клеток прокариотов

3.  Факультативные компоненты клеток прокариотов.

4.  Методы изучения структуры бактериальных клеток и их практическое значение.

5.  Бактериоскопический метод диагностики. Его достоинства и недостатки.

ПЛАН

Программа:

1.  Ультраструктура бактериальных клеток

2.  Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама

3.  Сложные методы окраски (методы Ожешко, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Нейссера )

Демонстрация:

1. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри-Гинса)

2.  Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза в мокроте (окраска по методу Циля-Нильсена)

3.  Спорообразующие бактерии (окраска по методу Ожешки)

4.  Зерна волютина у коринебактерий дифтерии (окраска по методу Нейссера)

Задание студентам:

1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате (окраска по методу Грама). Зарисовать.

2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и стфилококка, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическм признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

4.  Микроскопировать и зарисовать:

- капсулы клебсиелл (окраска по методу Бурри и Бурри-Гинса)

- коринебактерии дифтерии, содержащие зерна валютина (окраска по методу Нейссера)

- кислотоустойчивые микобактерии (окраска по методу Циля-Нильсена)

- споры бацилл сибирской язвы (окраска по методу Ожешки)

Информационный материал.

Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.

В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула, жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.

Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной субстанции бактерий от эукариотических клеток являются:

1.  Отсутствие ядерной оболочки

2.  Отсутствие ядрышка

3.  Отсутствие гистонов

Для обнаружения бактериального ядра необходимо применение электронной микроскопии или применение окраски по способу Фельгена или по Романовскому-Гимза.

Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициент седиментации 70S. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов окрашивания. Например, в цитоплазме у С. diphtheriae присутствуют зерна волютина, они являются включениями фосфатов и имеют в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию. Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.

Клеточная стенка бактерий придает им определенную форму, участвует в процессах обмена веществ и деления клетки.

У бактерий можно выявить присутствие клеточной стенки с помощью электронной микроскопии, при окрашивании по методу Грама, Циля-Нильсена.

Клеточная стенка грамположительных бактерий значительно толще, чем у грамотрицательных, в ней содержится значительное количество пептидогликана (40-90%) связанного с тейхоевыми кислотами. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана не превышает 10%.

Цитоплазматическая мембрана участвует в регуляции осмотического давления, в процессах обмена и транспорта веществ. Она окружает наружнюю часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом. Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.

Капсула расположена снаружи клеточной стенки, представляет собой слизистое образование, состоящее из полисахаридов или полипептидов. Она имеет защитное значение, у патогенных бактерий капсула образуется чаще всего внутри организма человека или животного и препятствует фагоцитозу, повышает устойчивость к действию антител.

Некоторые бактерии (например, клебсиеллы, псевдомонады) образуют капсулу и в организме больного, и на питательной среде, где они дают крупные, слизистые колонии.

Капсула выявляется при специальных методах окраски.

Споры образуются при неблагоприятных условиях внешней среды (Вас. аnthracis, С. tetani). Спорообразование способствует сохранению вида и не является способом размножения. У клостридий спора превышает диаметр клетки, у бацилл – нет. Форма спор может быть овальной или округлой. У С. Tetani споры расположены терминально, для Вас. Аnthracis характерно центральное расположение спор. Споры химически инертны, поэтому окрашиваются с трудом. Для выявления этих структур используют окраску по методу Ожешки.

Жгутики имеются у подвижных бактерий. Они состоят из белка флагеллина. Оределение подвижности бактерий имеет диагностическое значение. По числу жгутиков и их расположению бактерии делятся на монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи с пуч­ком жгутиков на одном конце клетки, амфитрихи имеют жгутики на обоих концах, и перитрихи, у которых жгутики расположены вокруг тела.

Жгутики можно обнаружить при электронной микроскопии после обработки тяжелыми металлами или в световом микроскопе после окраски по методу Леффлера, серебрения по Морозову.

Фимбрии и пили представляют собой нитевидные образования, расположенные на поверхности бактериальной клетки, состоящие из белка пилина. Существует несколько разновидностей фимбрий, которые отличаются друг от друга по выполняемым функциям: адгезия, питание, водно-солевой обмен. Пили участвуют в процессе конъюгации и образуются мужскими клетками-донорами.

Бактериоскопический метод диагностики основан на выявлении возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемом материале по морфологическим, тинкториальным свойствам по взаимному расположению с применением различных методов окраски или в нативном состоянии.

Сфера применения: метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическим, тинкториальными, свойствами и типичной локализацией в организме, Например: гонорея, сифилис, возвратный тиф, туберкулез, некоторых микозы.

К достоинствам метода относятся быстрота, доступность, экономичность. К недостаткам метода относятся недостаточная информативность, низкая чувствительность, невозможность дифференциации внутри вида.

Методические указания:

Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера:

1.  На фиксированный мазок нанести уксуснокислый метиленовый синий Нейссера на 2-3 мин.

2.  Промыть водой.

3.  Нанести дополнительный краситель - везувин.

4.  Промыть водой, высушить.

При окраске образуется нерастворимый в воде комплекс: краситель-валютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы валютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем окрашивается везувином в желтый цвет.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1.  На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.

2.  Промыть водой.

3.  Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.