Общая микробиология (стр. 11 )

Бактериофаги подобно другим вирусам являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

2.Классификация бактериофагов по характеру взаимодействия с микробной клеткой.

По характеру взаимодействия с микробной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию, заканчивающуюся образованием новых фаговых частиц и лизисом бактериальных клеток. Умеренные фаги вызывают интегративную инфекцию, не приводящую к лизису клеток. ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении по наследству. Такой тип взаимодействия фага с бактериальной клеткой называют лизогенией. А бактерии, несущие в своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной культуры сопровождается лизисом бактерий и просветлением среды.

Выделение фага из объектов окружающей среды. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют. После лизиса культуры оставшиеся бактерии удаляют центрифугированием или фильтрацией.

Методические указания:

Качественный метод определения фагов (метод Отто).

Чашку Петри с питательным агаром засевают бульонной культурой газоном. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашки, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

Фаготипирование бактерий.

Исследуемую бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, делят на квадраты, на которые наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают те квадраты, в которых имеется лизис бактерий. Фагопип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис.

Практическое использование бактериофагов.

1.  Фаготерапия. – применение бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний.

2.  Фагопрофилактика – применение бактериофагов для профилактики инфекционных заболеваний.

3.  Фагодифференцировка – применение бактериофагов для определения вида исследуемой культуры.

4.  .Фаготипирование – применение бактериофагов для внутривидовой идентификации исследуемых микроорганизмов (определение фаготипа)

5.  Санитарно-показательные микроорганизмы. Использование бактериофагов (колифагов) в качестве санитарно-показательных микроорганизмов.

Контрольные вопросы:

1.Каково строение бактериофага?

2. Назовите основные этапы взаимодействия фага с бактериальной клеткой?

3. Что такое профаг?

4.Какие качественные методы идентификации фагов Вам известны?

5. Какова методика титрования фагов в жидкой среде по Аппельману?

6. Назовите основные сферы применения бактериофагов в медицине.

Список литературы:

Обязательная:

1.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2.  , , Рыбакова . М., Медицина. 1998 г.

3.  , , Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4.  Борисов к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1.  , Кривошеин . М., 1980 г.

2.  , Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .

3.  Общая микробиология. М., Мир, 1982

Занятие № 9 Генетика микроорганизмов.

Цель: Ознакомиться с особенностями наследственности, видами изменчивости микроорганизмов, теоретическим и практическим значением генетики микроорганизмов, с современными методами генетических исследований и использованием их в медицинской практике.

Знать: Строение генома бактерий, виды изменчивости микроорганизмов, практическое применение методов генетики в народном хозяйстве, медицине.

Уметь: осуществлять постановку экспериментов по выявлению различных видов изменчивости.

Обоснование темы: для идентификации микроорганизмов применяют многие молекулярно-генетические методы, что значительно ускоряет постановку правильного диагноза.

Вопросы для самоподготовки:

1.Материальная основа наследственности.

2.Понятие о генотипе и фенотипе бактерий.

3.Виды изменчивости.

4. Классификация мутаций.

5. Репарации поврежденной ДНК.

6. Генетические рекомбинации у бактерий, механизмы и значение.

7. Классификация и роль плазмид.

8. ПЦР и ДНК-зонды, их применение.

ПЛАН

Программа:

1. Модификационная изменчивость. Пигментообразование при разных температурах. О и Н - формы при росте на МПА и среде Плоскирева.

2. Мутационная изменчивость.

3. Рекомбинантная изменчивость. Постановка опытов по трансформации, трансдукции и конъюгации.

4. Применение методов генетики в медицине.

Демонстрация:

1. Опыт по пигментообразованию.

2. Рост протея на МПА и среде Плоскирева.

3. Диссоциация энтеробактерий на различные формы колоний.

4. Эксперимент по различным видам рекомбинаций.

Задание студентам:

1.Заполнить таблицу: Классификация и функции плазмид.

2. Заполнить таблицу: Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики.

3. Описать различные виды колоний энтеробактерий при диссоциациях.

4.Учесть результаты опытов, поставленных с целью выявления трансдукции, трансформации и коньюгации. Сделать заключение.

Информационный материал.

Ген – структурная и функциональная единица наследственной информации, участок ДНК, контролирующий синтез определенного белка.

Геном - совокупность генов гаплоидного набора хромосом клетки.

Амплификация - увеличение числа копий генов / часто плазмид молекулярным весом / в клетке.

Элиминация - удаление генов из клетки / особенно плазмид под действием УФ, акридиловых красителей/.

Траспозоны - участки ДНК, способные к перемещению внутри молекулы и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.

Is – последовательности - нуклеотидные последовательности, не кодирующие выработку белка, а ответственные за встраивание транспозонов в молекулу ДНК.

Мутация - изменение генотипа.

Сексдуция - перенос фрагмента хромосомы F – фактора при конъюгации.

Трансдуцирующий фаг - умеренный фаг, который переносит бактериальные гены от донора к реципиенту.

Фактор компетенции - особый белок, создающий условия для трансформации в клетке.

Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей организации.

Особенности генетического аппарата бактерий:

а/ цитологические:

1.  Наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;

2.  В отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;

3.  В нуклеоиде нет ядрышек;

4.  В нуклеоиде одна хромосома;

5.  В бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида;

6.  Молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.

б/ молекулярные:

1.  Хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;

2.  Хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов;

3.  В ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных / минорных / азотистых оснований, или выполняют защитную функцию гистонов;

4.  ДНК бактерий содержит is – последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;

5.  Отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава:

Соотношение гуанина и цитозина /Г/Ц – индекс/ у бактерий имеет видовые отличия.

Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности / внехромосомная молекула ДНК, гены которой отвечают за ряд селективных свойств и способен к автономной репликации.

Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, is – последовательности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность / перенос, передачу/. Такие плазмиды называются трансмиссивными / конъюгативными/.

Основные свойства плазмид:

1.  Гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет;

2.  Плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу, чем хромосомная;

3.  Плазмиды способны к автономной репликации или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы;

4.  Для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации / многопийности/;

5.  Некоторые плазмиды /F, R – факторы/ способны находиться как в автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у которых F- фактор интегрирован с хромосомой, - H¦r – штаммы;

6.  Молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных;

7.  Некоторые физические /УФ, СВЧ и др./ и химические / акридиловые красители/ агенты вызывают алиминацию / удаление, потерю / плазмид;

8.  Плазмиду могут содержать tra – гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгурации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссионность /передача, перенос / плазмид может быть связан и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами;

9.  В клетке могут находится несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовместимости плазмид.

Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают:

1.  R – плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость;

2.  F – плазмиды – определяют пол бактерий;

3.  Col – плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов;

4.  Hlj - плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;

5.  Ert – плазмиды – детерминируют синтез энтеротоксина;

6.  Плазмиды биодегративные – обуславливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.