Общая микробиология (стр. 2 )

Конденсор состоит из системы линз, предназначенных для собирания лучей, идущих от зеркала, в одной точке — фокусе, который должен находиться в плоскости рас­сматриваемого препарата. При микроскопировании с дневным светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного столика; при искусственном освещении конденсор опускают до тех пор, пока при малом увеличении изображение источника света не появится в плоскости препарата. При изучении неокра­шенных объектов следует опускать конденсор.

Объем лучей регулируется диафрагмой, находящейся под конденсором. Окрашенные препараты рассматриваются при от­крытой диафрагме; при рассматривании неокрашенных объектов следует уменьшить диаметр отверстия диафрагмы.

Объектив - основной оптический элемент микроскопа. Он представляет собой си­стему линз, заключенных в металлическую оправу.

Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния, а следовательно, и от кривизны фронтальной линзы. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива.

Все объективы разделяются на сухие и иммерсионные. Сухим называют такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателей преломления стекла и воздуха, часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система. Ее преимущество перед сухими объективами состоит в том, что между стеклом и линзой устанавливается однородная среда (стекло препарата — масло — стекло объектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя своего направления, попадают в объектив, чем я достигается наилучшее освещение.

Разрешающая способность – возможность различать раздельно две близко расположенные точки. Для оптического микроскопа она равна 0,2 мкм. Для проведения иммерсионной микроскопии обычно пользуются кедровым маслом, показатель преломления которого почти равен показателю преломления стекла. При этом капля масла помещается на стекло препарата и в нее погружается иммерсионный объектив.

Окуляры имеют две линзы: верхнюю и нижнюю. Расстояние между линзами, равно полусумме их фокусных расстояний. Таким образом, по длине окуляра можно приблизительно определить общее фокусное расстояние. На окуляре указано значение его увеличения. Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра.

Окуляр дает только увеличение, объектив раскрывает качество изображения.

Электронный микроскоп.

В 1932 г. был изобретен электронный микроскоп, в котором вместо световых лучей используется поток электронов. При электронной микроскопии возможно рассматривать объекты, размер которых в 50—100 раз меньше видимых в обыкновенном микроскопе.

Увеличение даваемое электронным микроско­пом, равно 20000-40000 раз. При последующем оптическом увеличении в 4—5 раз можно получить полезное увеличение в. 100000—200000 раз.

По расположению линз и ходу лучей электронный микроскоп очень похож на проекционный оптический микроскоп. В зависимости от того, из каких линз собран микроскоп, различа­ют электростатические и электромагнитные микроскопы. Источником электронов в этом приборе является электронная пушка (электронно-лучевая трубка с ка­тодом, состоящим из раскаленной нити, и анодом-цилиндром). Вылетевшие из нити электроны разгоняются высоким электрическим напряжением (50 000— 100000 V). Вышедший из электронной пушки пучок электронов попадает в конденсорную электромагнитную линзу, которая сводит их на рассматриваемый предмет, лежащий на тонкой (1/1000000 см) пленке коллодия. После этого лучи попадают на объективную электромагнитную линзу, собирающую расходящиеся лучи и дающую первое (промежуточное) увеличение предмета.

Это изображение можно наблюдать на специальном промежуточном экране. В центре последнего сделано маленькое отверстие (апертурная диафрагма). Небольшая часть первого увеличенного изображения, равная отверстию промежуточного экрана, служит “предметом” для дальнейшего увеличения. Поток электронов через это отверстие попадает на проекционную электромагнитную линзу, снабженную апертурной диафрагмой. Второе увеличенное изображение, даваемое проекционной линзой, принимается на флюоресцирующий экран или на фотографическую пластинку Можно прибегнуть также к последующему оптическому увеличению.

С помощью электронной микроскопии удалось получить замечатель­ные результаты в области микробиологии: обнаружить многие важные особенности и детали морфологии микроорганизмов (морфология вирусов и бактериофага и др.).

Виды микроскопии

1.  Светлопольная микроскопия (микроскопия в проходящем свете) используется для изучения окрашенных объектов в фиксированных препаратах

2.  Темнопольная микроскопия

Применяется для прижизненного изучения микроорганизмов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля) Эффект достигается с помощью специального конденсора (парабалоид или кардиоид), которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе. При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенное поле зрения) видны ярко освященные частицы. Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центрируют, как и для светлого поля, заменяют конденсор на специальный, прибавляют свет до максимума, открывают конденсор до максимума. Для темнопольной микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля»

3.  Люминесцентная микроскопия.

Люминесценция – способность некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой длиной волны (например, таким свойством обладают ультрафиолетовые лучи). Объект, не видимый в ультрафиолетовом излучении, приобретает яркий блеск после обработки специальными веществами – флюорохромами.

Установка для люминесцентной микроскопии состоит из источника света с сине-фиолетовым фильтром и микроскопа. На окуляр микроскопа надевают желтый светофильтр.

Преимущества люминесцентной микроскопии:

1.цветное изображение

2.высокая степень контрастности объектов

3.возможность исследования непрозрачных объектов

4.возможность исследования динамики жизненных процессов

5.обнаружение локализации отдельных микроорганизмов, вирусов

6.развитие методов цитогистохимии, экспрессная цитодинамика.

Фазово-контрастная микроскопия

Предназначена для нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть прозрачные объекты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое простым глазом. Фазовое устройство состоит из особого конденсора и объектива и обеспечивает преобразование изменение фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различий в оптической плотности объектов.

Для фазово-контрастной микроскопии используется обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство КФ-1, КФ-4 и специальные осветители.

4.  Электронная микроскопия.

Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа.(0,2 мкм). Применяются для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов.

Световые лучи в этом микроскопе заменяют поток е, имеющий 0,005 нм. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа (0,1-0,2 нм) позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000.

Термостат

Используется для роста и размножения микроорганизмов.

В термостате поддерживается постоянная температура при помощи терморегуляторов. которые как только температура достигнет установленного уровня, автоматически уменьшают или прекращают доступ притока тепла.

Термостаты имеют двойные стенки, меж­ду которыми находится воздух или вода, подогреваемая источником тепла. Дверца термостата герметически закрывается. Термостат снабжен термометром Культуры бактерий чаще всего помещают в термостат на 24 часа — срок, обеспечивающий максимальное размножение большинства патогенных микроорганизмов.

Холодильник.

Используется для хранения культур микроорганизмов, иммунобиологических препаратов.

Центрифуга.

Используется для разделения жидкостей с различной плотностью, для получения сыворотки крови, для разделения твердых тел от жидкостей.

Сушильный шкаф.

Имеет несколько температурных режимов. Применяется для сушки лабораторной посуды.

Бактериоскопический метод состоит в. изучении микроорганизмов под микроскопом. Исследованию могут подвергаться как микроорганизмы в живом состоянии, так и убитые окрашенные микробные клетки.

Методические указания:

Приготовление препаратов для микроскопического исследования.

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой.

Петлю прокаливают в пламени спиртовки. Вращательным движением вынимают из пробирки пробку и обжигают край пробирки. Вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, захватывают материал. После приготовления препарата петлю прожигают в пламени спиртовки.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков.

1.Для приготовления препарата подготавливают предметное стекло, обезжиривая его.

2.На обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и равномерно распределяют ее по поверхности стекла.

3.Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки.

4.Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько раз через пламя горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом ( спиртами, смесью Никифорова и т. д.).

Этапы приготовления фиксированного мазка:

1.Подготовка предметного стекла

2.Приготовление мазка

3.Высушивание микропрепарата

4.Фиксация микропрепарата

Окраска препарата простым способом.