Оценка цитопротекторного эффекта препаратов, имеющих антиоксидантный механизм действия при экспериментальном остром панкреатите (стр. 2 )

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть работ, одна из которых в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 148 страницах машинописного текста. Состоит из шести глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 186 отечественных и 67 иностранных источников. Работа содержит 18 таблиц и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Животные

Работа выполнена на 50 разнополых беспород­ных половозрелых собаках массой от 6,6 до 10,4 кг.

Препараты

В исследованиях использованы следующие лекарственные средства: Винпоцетин – 000182/02-2003 от 01.01.2001. ФГУП «Мосхимфармпрепараты» им ; димефосфон – раствор 15% - 83 / 654 / 13. ; альфа-токоферола ацетат – 71/945/35 73941/12 от 01.01.2001 .

Модель острого панкреатита

У всех животных за 48 часов до начала эксперимента производился забор периферической крови с последующим лабораторным изучением показателей перекисного окисления липидов и функционального состояния эритроцитов. Эти показатели были приняты за норму (исход) и отображены в автореферате на графических рисунках, как 100%.

Все экспериментальные исследования, касающиеся хирургического пособия, проводились под внутривенным наркозом, с использованием тиопентала-натрия из расчета 0,04 г/кг массы животного. Панкреатит моделировали по методу с соавт. (1989). Собакам выполняли срединную лапаротомию, пунктировали желчный пузырь, забирали желчь с последующим лигированием места пункции. Затем желчь вводили в паренхиму вертикальной части поджелудочной железы по 0,6 мл в 5 точек.

В послеоперационном периоде всем животным проводили инфузионную терапию (внутривенные введения 5% раствора глюкозы и 0,89% раствора хлорида натрия из расчета 50 мл/кг массы животного). У всех животных в контрольные сроки (на первые, третьи и пятые сутки) осуществляли забор крови для изучения отдельных показателей функционального состоя­ния эритроцитов, качественного и количественного состава липидов, интенсивности процессов ПОЛ, активности фосфолипазы А2, каталазы и супероксиддисмутазы тканей поджелудочной железы и эритроцитов. Выборочно производился забор биоптата. Схема исследований представлена в таблице №1. Препараты антиоксидантного действия вводились в терапевтической дозе, рекомендуемой в справочной литературе и на основании собственных исследований при отработке модели острого панкреатита.

Таблица 1. Схема постановки и проведения исследований

№	Группы	Число животных	Режимы введения препаратов
I	Контрольная	15	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию.
II	Альфа-токоферола ацетатат	10	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию и вводили альфа-токоферол ацетат 5-ти кратно, в дозе 5 мг/кг/сутки, внутримышечно.
III	Димефосфон	10	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию и вводили димефосфон 5-ти кратно, в дозе 50 мг/кг/сутки, внутривенно.
IV	Винпоцетин	15	Собакам с экспериментальным острым панкреатитом в течение 5 дней проводили ежедневную инфузионную терапию и вводили винпоцетин 5-ти кратно, в дозе 1 мг/кг/сутки, внутривенно.

Методы исследования:

1. Определение липидов: Липиды из гомогената ткани поджелудочной железы и эритроцитов периферической крови экстрагировали хлороформметаноловой смесью, фракционировали методом тонкослойной хроматографии на силикагелевых пластинах. Полярные фосфолипиды разделяли на пластинах фирмы Merk (США) на стеклянной основе, нейтральные липиды фракционировали на силикагелевых пластинах для обращенно-фазной тонкослойной хроматографии (Россия) (Хиггинс Дж. А., 1990; Vaskovsky V. E. et al., 1975). Количественное определение липидов проводилось на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware).

2. Определение диеновых и триеновых конъюгатов проводилось по методу ( ,1986).

3.Содержание малонового диальдегида оценивалось в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу (, , 1987). Для определения антиокислительной активности липидов предварительно проводилась индукция липопереокисления раствором сульфата железа в концентрации 5 мкмоль в течение часа.

4. Активность супероксиддисмутазы оценивалась в реакции с нитросиним тетразолием ( С. и др., 1990).

5. Активность каталазы определялась фотометрическим методом по методу (, 1988). Активность каталазы выражалась в мг Н2О2/мин/г белка.

6. Активность альфа-амилазы определялась методом ферментативного гидролиза крахмала, данные регистрировались на ФЭКе при длине волны 630–690 нм (красный светофильтр) ( и др., 1991).

7. Определение активности фосфолипазы А2 проводилось по методу В. А Трофимова (, 1999). Активность фосфолипазы А2 оценивалась в среде, содержащей 10 ммоль трис-HCL-буфер (pH 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль CaCl2 и субстрат (1,2 ммоль). В качестве субстрата использовались фосфатидилхолины яичного желтка. Регистрация каталитической деятельности фермента проводилась титрометрическим методом по мере образования свободных жирных кислот. Расчет осуществлялся по калибровочной кривой, построенной по пальмитиновой кислоте, и выражался в мкмоль/с/г белка.

8. Выделение эритроцитов. Кровь для исследования липидного состава мембран эритроцитов забиралась в пластиковую стерильную пробирку. Немедленно после забора крови эритроциты отделялись от плазмы путем центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин. Плазма отбиралась, кольцо белых клеток отбрасывалось, а эритроциты промывались 5-ю объемами 0,05 М Трис HCl (рН= 7,2 буфера) содержащего 150 ммоль хлорида натрия.

9. Определение деформабельности эритроцитов проводилось по методу , 1986. Определялось время, необходимое для полного растекания капли - Т1 и времени растекания эритроцитарной суспензии - Т2. Расчет индекса деформабельности эритроцитов производился как отношение Т1 к Т2.

10. Определение сорбционной способности эритроцитов проводилось по методу и др.,1988. Эритроциты отделялись путем центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин. Плазма удалялась, 1мл эритроцитарной массы переносился в пробирку, содержащую 3 мл 0,025% раствора метиленового синего, приготовленного на 0,9% растворе NaCl. Оптическая плотность надосадочной жидкости определялась на длине волны 630 нм. Количество поглощенного красителя (в процентах) вычислялось по формуле:

Еа=100-(С*100/ВF),

где А – количество поглощенного красителя, В – оптическая плотность исходного раствора.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с использованием критерия t Стьюдента. Вычисления проводились на CPU 1600 MHz “Intel Pentium-IV” с помощью пакета программ Microsoft Office XP. Использовался текстовый процессор Microsoft Word 2003. Динамика показателей отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных таблиц Microsoft Excel 2003.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования показали, что выбранная экспериментальная модель острого панкреатита оказалась адекватной для решения поставленной задачи. На следующие сутки после введения желчи в паренхиму поджелудочной железы у животных развивались клинические, морфологические, лабораторные признаки заболевания. Макроскопическая оценка состояния поджелудочной железы при остром панкреатите выявила наличие выраженных признаков воспалительного процесса в ткани пораженного органа в виде отека, гиперемии, кровоизлияний, а в ряде случаев – участков некроза паренхимы органа. Установлено, что при формировании отечной формы острого панкреатита максимальной выраженности воспалительные явления достигали к третьим суткам эксперимента, а на пятые уже отмечалась положительная динамика восстановления макроскопической картины органа. Развитие деструктивной формы наблюдалось в 6 случаях, и сопровождалось прогрессивным нарастанием всех признаков воспалительного процесса в органе, что в итоге приводило к тотальному некрозу паренхимы поджелудочной железы (панкреонекрозу), обуславливая летальность животных.

При изучении активности α-амилазы крови выявлено, что она существенно возрастала уже на первые сутки динамического наблюдения и превышала исходный уровень на 144,58%. На третьи сутки эксперимента активность энзима продолжала расти, достоверно превышая норму на 295,81% . На пятые сутки исследования активность α-амилазы начинала уменьшаться, но оставалась выше исходного уровня на 160,91%.

Известно, что сохранность структурно-функциональной архитектоники клетки, а, следовательно, и ткани в целом во многом зависит от сбалансированности процессов перекисного окисления липидов ( и др., 2000). Изучение интенсивности процессов липопереокисления и ферментативной активности в тканях поджелудочной железы при остром панкреатите на фоне применения стандартной инфузионной терапии показало, что при данном заболевании отмечается существенная интенсификация процессов перекисного окисления липидов. Так, при остром панкреатите, содержание первичных и вторичных продуктов в ткани пораженного органа возрастало на 86,96 – 160,00% и 109,20 – 318,69% соответственно. Установлено, что при остром панкреатите отмечается значительная интенсификация активности фосфолипазы А2 на 520,88 – 770,33%. Указанные изменения в ткани поджелудочной железы отмечались на фоне угнетения собственного антиоксидантного ферментного потенциала органа, что было зафиксировано в виде снижения активности супероксиддисмутазы (СОД) на 19,92 - 50,04%. Выявлено, что максимальной выраженности указанные изменения достигали к третьим суткам эксперимента (рис. 1).