Колонии. На обогащенных агаровых средах колонии Francisella tularensis мелкие, в виде капелек беловатого цвета с голубоватым отливом, круглые, с ровным краем, выпуклые и блестящие. При разреженном посеве через несколько суток достигают диаметра 2 мм и более (рост становится заметным с 3-5 суток культивирования). Изолированные колонии удобно получать при посеве на среды О. Емельяновой или Маккоя; используют также агар с переваром сердечной мышцы, дополненный 5% крови барана или кролика. Колонии вирулентных штаммов по морфологии и биологическим свойствам соответствуют S-диссоциатам. На жидких средах размножаются хуже и только у поверхности среды, что связано, по-видимому, с аэрофильностью бактерий; более удовлетворительных результатов достигают аэрацией среды или внесением биоколлоидов (яичного желтка, агара и т. д.).
Культуральные свойства
У Francisella tularensis оптимальный рост наблюдают только в аэробных условиях; температурный оптимум 36-37°С (пределы 5-43оС). Бактерии культивируют на сложных агаровых или желточных средах с добавлением тканевых экстрактов, цистеина, кроличьей дефибринированной крови и других питательных веществ. Включение в питательную среду полимиксина В или пенициллина подавляет рост других микроорганизмов. Ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, левулезу и маннозу (американские, среднеазиатские и японские штаммы дополнительно и глицерин), но определить эту способность можно только на специальных средах с ограниченным содержанием белка и точно определенным рН: наиболее точные результаты ферментации углеводов и спиртов получают манометрией на аппарате Варбурга. Имеют следующие ферменты: каталазу, глутаминазу, аспарагиназу, дез - и трансаминазу, цитруллинуреидазу. Индол не образуют, продуцируют аммиак и сероводород, редуцируют некоторые краски, например тионин, метиленовый синий, малахитовый зеленый и др. Работа с кровью, мокротой или аспиратами лимфатических узлов больного связана с большим риском для сотрудников лаборатории и предъявляет особые требования к ее оснащению и квалификации персонала.
Патогенез
После проникновения возбудителя в организм его дальнейшее распространение происходит, как правило, с током лимфы и реже через кровоток, куда он попадает позднее (что создает угрозу генерализации). Фагоциты активно поглощают Francisella tularensis, но они не способны к их внутриклеточному киллингу, что создает предпосылки для депонирования бактерий в лимфатических узлах. Часть возбудителей при этом погибает, что сопровождается выделением эндотоксина, действующего на узел и окружающие ткани. Таким образом, вслед за стадией лимфогенного заноса развивается стадия очаговых реакций, в результате чего формируются туляремийные бубоны. По аналогии с чумой человека последние разделяют на первичные (возникают метастатически лимфогенно и связаны с местом входных ворот) и вторичные, а также на бубоны первого порядка, второго и т. д., учитывая время их появления. Периодически из сформированных очагов возбудитель проникает в лимфо - и кровоток, что сопровождается выделением новых порций эндотоксина и сенсибилизацией (регистрируют кожными пробами). Прорывы бактерий могут приводить к метастазированию в печень, селезенку, легкие, костный мозг и другие органы, что обусловливает вторичные поражения (например, вторичную пневмонию, менингит и т. д.).
Лабораторная диагностика
Предположительный диагноз основывают на соответствующем анамнезе и клинических проявлениях.
Наиболее достоверные результаты дает выделение Francisella tularensis (рис. 14), однако культивирование возбудителя сопряжено не только с трудностями, но и с угрозой заражения персонала и разрешено только в лабораториях особо опасных инфекций.
Рисунок 14. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителя туляремии
При отсутствии возможности выделения возбудителя используют биологический метод, основанный на заражении лабораторных животных (мышей или морских свинок) патологическим материалом (пунктат бубона, слизь из зева, гнойное отделяемое слизистой оболочки глаза, кровь и т. д.) с последующей идентификацией микроба агглютинирующей сывороткой. Материал из бубона следует брать до 14-20 суток болезни, из слизистой оболочки глаза — до 17 суток, кровь — до 6 дня заболевания.
Серологические методы. Наличие AT к Francisella tularensis в сыворотке больного определяют в реакции агглютинации с туляремийным диагностикумом; положительной считают видимую глазом реакцию при разведении сыворотки 1:100 и больше (положительные результаты на 1 неделе выявляют у 12,5% больных, на 4 — у 93,2%). Возможна экспресс-диагностика, основанная на идентификации Аг в мазках из очагов поражений AT, меченными флюоресцеинами.
Для ранней диагностики эффективна аллергическая кожная проба. В качестве Аг используют тулярин — взвесь бактерий, убитых нагреванием до 70°С.
Питательные среды для культивирования франциселл
Пептон-цистеиновый агар. В 1 л дистиллированной воды растворяют 20 г пептона, 10 г натрия хлорида, 1 г глюкозы, 1 г хлористоводородного цистеина. Добавляют 20 г агар-агара. Нагревают до закипания и кипятят 1 минуту. Разливают в чашки, проверяют на стерильность выдерживанием чашек при 37°С 24 ч.
Свернутая желточная среда (МакКой-Чепин). К 20 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7—7,2 добавляют 20 мл аутолизата пивных дрожжей и 60 мл желтка куриных яиц. Перемешивают, разливают в чашки или пробирки и выдерживают 1 ч при 80°С.
Приготовление аутолизата пивных дрожжей. Пивные дрожжи отмывают от сусла водопроводной водой. Сливают в колбу и помещают на 24 ч в водяную баню при 56-58°С. Кипятят 20 минут. Подщелачивают гидроокисью натрия до слабощелочной реакции. К 1 части аутолизата дрожжей добавляют 2 части воды, кипятят 40 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают в колбы и стерилизуют при 120°С 30 минут.
Мартеновский дрожжевой агар. К 930 мл мартеновского бульона добавляют 70 мл аутолизата пивных дрожжей, 10 г глюкозы, 1 г цистеина, 0,4 г хлорида калия, 3 г хлорида натрия, 0,1 г натрия бикарбоната, 0,3 г магния сульфата, 0,8 г натрия фосфата двуосновного. Доводят рН смеси раствором гидроокиси натрия до 7,2-7,4. Добавляют 30 г агар-агара, кипятят до его расплавления. Разливают в пробирки и стерилизуют 20 минут при 120°С.
Среда Емельяновой. К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 мл гидролизата свежей рыбы, 10 мл гидролизата желатина, 2,5 мл аутолизата пивных дрожжей, 0,5 г натрия хлорида, 1 г глюкозы, 0,1 г цистеина и 2 г агар-агара. Нагревают до расплавления агара. Разливают в колбы и стерилизуют 20 минут при 120°С. Перед употреблением в расплавленную среду добавляют 10% дефибринированной крови кролика и разливают в чашки.
Полужидкая среда Дрожевкиной. К 90 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида рН 7,0-7,2 асептически добавляют 10 мл суспензии желтка куриных яиц, перемешивают и разливают в пробирки. После проверки на стерильность используют.
Среда Ухалова-Михалевой. К 100 мл основного перевара Хоттингера добавляют 250 мл сычужного пептона, 4 г натрия хлорида и кипятят 3 мин. Устанавливают рН 7,2-7,4, вновь кипятят 3 минуты и фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 20 г предварительно замоченного агар-агара и нагревают до его расплавления. Разливают в колбы, стерилизуют 20 минут при 120°С.
Приготовление сычужного пептона. К 400 г свежеприготовленного фарша из обезжиренного сычуга крупного рогатого скота добавляют 1 л 1%-ного раствора соляной кислоты. Встряхивают и оставляют на 2-3 суток при 46-48°С до образования на дне бутылки порошкообразной массы и появления положительной реакции на триптофан. Смесь прогревают 10 минут при 80°С на водяной бане. Отстоявшийся от осадка прозрачный раствор пептона декантируют, добавляют 2% хлороформа. Хранят при 10°С.
Среда Анциферова. К 100 мл расплавленной и охлажденной до 45°С среды Ухалева-Михалевой добавляют 5 мл (3:2) желтка куриных яиц в 0,5% растворе хлорида натрия. Разливают по пробиркам и скашивают при нагревании до 65°С.
Среда Френсиса. К 100 мл мясного настоя добавляют 1 г пептона, 0,5 г натрия хлорида, 1,5-2% агар-агара и нагревают его до расплавления. Вносят 0,1 г цистеина, 1 г глюкозы. Устанавливают рН 7,2-7,4. Стерилизуют при 110°С 30 минут. В расплавленную после стерилизации и охлажденную до 45°С среду добавляют 5-10% дефибринированной крови кролика. Разливают по пробиркам и чашкам.
Микроорганизмы рода Yersinia
Общая характеристика
Род Yersinia организован в 1946 году и назван (по предложению ван Логхема) в честь Александра Иерсена. Ранее бактерии данного рода относили к роду Pasteurella. Сейчас род Yersinia включает микроорганизмы 11 видов (Y. aldovae, Y. bercow, Y. enterocolitica, Y. fredenksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei и Y. ruckeri), типовой вид — Y. рestis. С 1954 г бактерии рода Yersinia включены в семейство Enterobacteriaceae.
Морфология
Наиболее часто клетки иерсинии имеют овоидную форму (коккобациллы), с повышением температуры культивирования (от 37оС) бактерии имеют чаще форму палочек. Окрашиваются грамотрицательно, возможна биполярная окраска (может служить дифференциальным признаком при исследовании на Y. pestis). Палочки склонны к полиморфизму, образуя в субоптимальных условиях нитевидные, колбовидные или шарообразные (инволюционные) формы (например, на агаре с содержанием поваренной соли). В зависимости от вида (некоторые штаммы Y. ruckeri и вид Y. рestis) и температуры культивирования они могут быть подвижными и неподвижными споронеобразующими палочками (иногда коккобациллами) размерами 1-3´0,5-0 8 мкм. Бактерии неподвижны при 37°С, но подвижны при выращивании с температурным режимом ниже 30°С (подвижные виды - перитрихи). Некоторые штаммы Y. ruckeri и все изоляты Y. pestis неподвижны (но броуновское движение очень выражено) и имеют капсулу, а остальные виды – капсульное вещество.
Для Y. pestis характерны морфологически обособленный нуклеоид, наиболее хорошо видимый у инволюционных гигантских клеток и отсутствие подвижности.
Виды Yersinia образуют серовато-слизистые (S-формы) или шероховатые R-колонии, также выделяют переходные формы. Вирулентные штаммы образуют R-колонии. Микроскопическое изучение колоний Y. pestis выявляет колонии двух типов: молодые — микроколонии с неровными краями («битое стекло»), позднее они сливаются, образуя нежные плоские образования с фестончатыми краями («кружевные платочки»), зрелые — крупные с бурым зернистым центром неровными краями («ромашки»). Многие, особенно вирулентные, штаммы Y. pestis способны образовывать темный пигмент, восстанавливать красители (янус зеленый, индиго, метиленовый синий) в реакциях дегидрирования. На скошенном агаре через 48 ч при 28° С образуют серовато-белый налет, врастающий в среду. На бульоне через 48 ч образуют нежную пленку на поверхности и хлопьевидный осадок, при выращивании в аэрированном бульоне дают гомогенный рост, также хорошо растут на желатине, не вызывая ее разжижения.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 |
Основные порталы (построено редакторами)