Получены принципиально новые данные в исследованиях показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом в фазе (3−5 летней) ремиссии, указывающие на то, что именно алкогольная интоксикация является патогенным фактором для иммунной системы. Впервые показано также, что при прекращении употребления алкоголя больными на II стадии алкоголизма в фазе ремиссии восстанавливаются все параметры иммунной системы и исчезает иммунодефицит, что свидетельствует о временном, транзиторном, характере иммунодефицитного состояния у больных с алкогольной зависимостью.
Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу лечения иммуномодулирующих препаратов при условии продолжающегося употребления алкоголя.
Обнаруженные изменения параметров иммунной системы в результате действия алкогольной интоксикации следует учитывать в научно-практических и лечебно-профилактических учреждениях и центрах при исследовании иммунного статуса и проведении клинических анализов крови, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке, во-первых, ошибочного диагноза воспалительного процесса, а, во-вторых, ошибочного диагноза иммунодефицитного состояния.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Этанол in vitro в культурах клеток крови человека в диапазоне доз 6×10-5–6×10-1 мг/мл не влияет на спонтанную пролиферацию лимфоцитов, однако статистически значимо усиливает последующую индукцию делений Т-лимфоцитов митогенным лектином Con A; приводит к значимому повышению экспрессии активационных молекул CD25, CD38, HLA−DR на CD8+-лимфоцитах и молекул HLA I класса на клетках крови, а также приводит к статистически значимому снижению кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, индуцированной зимозаном и форбол-меристат-ацетатом (ФМА).
2. Алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям клеточного иммунитета у обследованных лиц, а именно:
− изменениям гемограммы; пролиферативной активности T - и В-лимфоцитов; цитолитической активности NK-клеток; фагоцитарного звена иммунной системы;
− изменению популяционного состава клеток крови, которое выражается снижением в периферической крови процента CD4+ Т-лимфоцитов, отношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов и увеличением процента CD19+ B-лимфоцитов.
− увеличению в периферической крови процента активированных CD8+DR+ Т-лимфоцитов, изменению процента активированных CD4+ Т-хелперов и NK-клеток, экспрессирующих DR-молекулы.
3. Алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям гуморального иммунитета, а именно:
− изменению иммуноглобулинового профиля;
− изменению содержания комплемента и его компонентов;
− изменению содержания циркулирующих иммунных комплексов;
− изменению содержания цитокинов – IL-4, IL-2 и IFN-γ в периферической крови.
4. Статистически значимое повышение кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, увеличение цитолитической активности NK-клеток, повышение экспрессии молекул HLA I класса и экспрессии активационных молекул на CD8+-лимфоцитах, а также увеличение в периферической крови процента активированных CD8+-лимфоцитов могут явиться предпосылкой для развития соматической патологии у лиц, злоупотребляющих алкоголем.
5. Тяжесть нарушений клеточного и гуморального иммунитета возрастает по мере увеличения количества потребляемого алкоголя и длительности его потребления.
Публикации
Основное содержание диссертации изложено в 39 публикациях, в том числе 24 публикациях в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 публикациях в периодической научной печати, главе в монографии, 12 публикациях в материалах научных конгрессов и конференций.
Апробация результатов диссертации
Результаты исследования доложены на 2-ом Национальном конгрессе РААКИ (Москва, 1998 г.); на XIV съезде психиатров России (Москва, 15 – 18 ноября 2005 г.); конференции – Современные достижения наркологии, посвящённой 20-летию Национального научного центра наркологии (Москва, 21 – 22 ноября 2005 г.); на Международном конгрессе “Иммунитет и болезни: от теории к терапии” (Москва, 3 – 7 октября 2005 г.); на ХI Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе (Санкт-Петербург, 28 – 31 мая 2007 г.); на VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, 27 – 29 июня 2007 г.); на I Российском национальном конгрессе по наркологии с международным участием (Москва, 24 – 27 ноября 2009 г.); на ХIV Всероссийском научном Форуме с международным участием им. И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2011” (Санкт-Петербург, 23 – 26 мая 2011 г.); на VII Российской конференции, посвящённой 90-летию со дня рождения академика РАМН Г. Н. Крыжановского “Нейроиммунопатология” (Москва, 13–14 ноября 2012 г.); на Третьей Всероссийской конференции с международным участием “Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии” (Томск, 5–6 марта 2013 г.).
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: “Введение”, “Цели и задачи исследования”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы исследования”, “Результаты собственных исследований и обсуждение”, “Заключение”, “Выводы” и “Библиография”. Список литературы представлен 229 библиографическими источниками, в том числе 89 отечественных и 140 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 61 таблицами и 38 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro.
Биологическим материалом для проведения исследований служила венозная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки “Vacutainer“ с гепарином. В работе использовали цельную кровь и мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови, в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин “Gibco” d=1,077 г/см3 по общепринятой методике [Boym A., 1968]. Клетки культивировали при 37о C в атмосфере с 5% СО2 в полной питательной среде (ППС), в состав которой входила среда RPMI (“Sigma Chemical Co”, USA), дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой (“Sigma Chemical Co”, USA), 2 mM L-глутамина (“Gibco”, USA), 20 mM HEPES-буфера (“Gibco”, USA) pH 7,4 и 10 мкг/мл гентамицина (“Gibco”, USA).
Изучалось влияние этанола in vitro на способность Т-лимфоцитов усиливать синтез ДНК, цитолитический эффект NK клеток, экспрессию на лимфоцитах активационных молекул − CD25, CD38, HLA–DR и экспрессию молекулы HLA I класса на клетках крови; функциональную активность фагоцитирующих клеток. Для выполнения этих задач был выбран широкий диапазон доз этанола, включающий: критические дозы (6 мг/мл); дозы, вызывающие сильное (0,6×10-1 мг/мл) или слабое (6×10-2 мг/мл) опьянение, и дозы, практически не влияющие на организм человека (6×10-3 мг/мл и ниже). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, употребивших алкоголь в различных количествах [ И. и др., 1967].
Методы изучения влияния этанола на пролиферативную активность T - лимфоцитов на модели реакции бластной трансформации in vitro. Биологическим материалом для исследований служила цельная периферическая кровь здоровых лиц, взятая в пробирки с гепарином. Влияние этанола на пролиферативную активность T-лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) без или с применением митогенных лектинов PHA (“Sigma”, USA) в концентрации 5 мкг/мл и Con A (“Sigma”, USA) в концентрации 5 мкг/мл. Контролем служили клетки из той же цельной крови без внесения этанола и культуры без этанола, но с добавлением митогенных лектинов. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения метил-3Н1-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Радиоактивность образцов измеряли на β-счётчике (“Wallac 1409 DSA”, Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (CPM) и рассчитывали для каждой культуры. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражали средними арифметическими значениями имп/мин (CPM).
Метод изучения влияния этанола на цитолитическую активность NK-клеток на модели естественной цитолитической активности in vitro. Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной периферической крови, как указано выше. Влияние этанола на цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro. Метод основан на способности NK-клеток in vitro лизировать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562, меченные 3Н1-уридином. В культуры вносили этанол в концентрациях (6×10-5–6×10-1 мг/мл), контролем служила смесь мононуклеаров и культур К-562, меченых 3Н1-уридином без этанола. Радиоактивность образцов измеряли на β-счётчике “Wallac 1409 DSA” (Finland). Результаты измерения выражались в имп/мин (CPM) в расчете на каждую культуру. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(1 – средние значения CPM в опытных культурах : средние значения CPM в контрольных культурах) × 100%.
Метод изучения влияния этанола на экспрессию на лимфоцитах молекул CD25, CD38, HLA–DR и HLA I класса на клетках крови человека in vitro. Биологическим материалом для исследования служила цельная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки “Vacutainer” с гепарином. Экспрессию молекул активации − CD25, CD38 и HLA–DR – определяли по интенсивности флуоресценции, которую выражали в условных единицах, у. е. − MFI (mean fluorescence unit), всех позитивных CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов и CD3-56+ NK-клеток. Экспрессию молекул HLA I класса определяли по интенсивности флуоресценции (у. е.) всех позитивных клеток крови (моноцитов, T - и В-лимфоцитов, нейтрофилов и NK-клеток).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
Основные порталы (построено редакторами)