Метод определения содержания цитокинов – IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α и IFN-γ Количественное определение содержания в сыворотке крови цитокинов – IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α и IFN-γ проводили методом твердофазного ИФА с применением тест систем “Cytimmune” (USA). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра – ридера “MRX Microplate Reader” (“Dinex Technology Ins.”, USA) при длине волны 490 nm. Метод определения продукции лейкоцитами IFN-γ при индукции клеток крови митогеном PHA in vitro. Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, выделенные из гепаринизированной крови, как указано выше [Boym A., 1968]. Для индукции IFN-γ использовали фитогемагглютинин (PHA) “Sigma” (USA) 5 мкг/мл ППС (мононуклеары культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной питательной среде при 37о C в атмосфере с 5% СО2, время культивирования 48 часов). По завершении инкубации планшеты центрифугировали, затем собирали супернатанты в стерильные пробирки “Eppendorf”, которые хранили до анализа при –20о С. Содержание IFN-γ в культуральной среде определяли с помощью твердофазного ИФА с применением тест систем “Cytimmune” (USA), постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра – ридера “MRX Microplate Reader” (“Dinex Technology Ins.”, USA) при длине волны 490 nm.
Методы статистической обработки результатов исследований
Статистическую обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики на персональном IBM-совместимом компьютере с применением пакетов прикладных программ «Microsoft Excel 2007» и «Biostatistics».
Результаты представлены в виде средней (М) ± стандартное отклонение (σ). Сравнение групп здоровых добровольцев после нагрузки алкоголем и больных алкоголизмом с группой здоровых (норма) проведено с использованием t-критерия Стьюдента при условии нормального распределения признаков. Различия считались достоверными при p<0,05 [Реброва, О. Ю., 2003; Glantz, 1999].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.Влияние этанола на иммунокомпетентные клетки крови здоровых лиц в культурах in vitro
Для выяснения механизмов влияния этанола на клетки крови нами было проведено исследование действия различных концентраций этанола in vitro на иммунокомпетентные клетки периферической крови здоровых лиц. Биологическим материалом для исследования служили образцы периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя. Нами был выбран широкий диапазон концентраций этанола – от критических (6 мг/мл) до нейтральных (6×10-5 мг/мл). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, и употребивших различные количества алкоголя ( И. и др., 1967). В соответствии с этим исследованы in vitro дозы этанола, не влияющие на человека (6×10-5 −6×10-3 мг/мл); дозы, вызывающие слабое (6×10-2 мг/мл) и сильное (6×10-1 мг/мл) опьянение, и критические дозы, приводящие к смертельному исходу (6 г/кг массы тела).
1.1. Влияние этанола на синтез ДНК лимфоцитами крови человека
Исследовали влияние различных концентраций этанола на способность лимфоцитов цельной крови спонтанно инициировать клеточное деление in vitro. В одном варианте экспериментов на весь период культивирования лимфоцитов цельной крови от 10 здоровых лиц (72 часа при 37оC в атмосфере влажности с 5% CO2) этанол вносили в отсутствии митогенных лектинов PHA и Con A. Во втором варианте этанол вносили вместе с митогенными лектинами (кровь от 10 здоровых лиц), а в третьем варианте лимфоциты цельной крови (от 10 здоровых лиц) инкубировали 3 часа в тех же условиях в присутствии митогенных лектинов, после чего вносили этанол (оценка влияния этанола на индуцибельную фазу иммунного ответа).
Результаты исследования влияния in vitro широкого диапазона концентраций этанола на лимфоциты цельной крови представлены на рис. 1. Из рисунка видно, что этанол в концентрации 6 мг/мл полностью подавляет спонтанный пролиферативный ответ лимфоцитов (их способность к делению). Концентрация этанола 6×10-1 мг/мл статистически значимо подавляет спонтанный пролиферативный ответ лимфоцитов, дозы этанола от 6×10-2 мг/мл и ниже не влияют на спонтанную пролиферацию лимфоцитов in vitro, в сравнении с клеточными культурами без внесения этанола. Полученные результаты свидетельствуют о том, что этанол при внесении его в культуры клеток крови in vitro не индуцирует пролиферацию лимфоцитов, а в высокой концентрации (6 мг/мл), напротив, подавляет её. Причём, этанол в концентрации 6 мг/мл вызывает гибель клеток крови, что было подтверждено подсчётом клеток в камере Горяева, т. е. обладает выраженным цитостатическим эффектом.
Рис. 1. Уровень спонтанной пролиферации (СП) лимфоцитов (имп/мин) периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя в присутствии этанола в сравнении с контрольными культурами в отсутствии этанола; *** – p<0,0001 – статистически значимое отличие от контроля; t-критерий Стьюдента
Таким образом, можно сделать заключение, что этанол не влияет на пролиферацию (деление) лимфоцитов крови человека (в диапазоне доз не подавляющих жизнеспособность) и не способен инициировать иммунный ответ.
Далее мы установили, что этанол в конечных концентрациях 6×10-1–6 мг/мл, вносимый в культуры лимфоцитов крови человека вместе с митогенными лектинами PHA или Con A, подавляет пролиферативный ответ лимфоцитов на эти митогенные стимуляторы по абсолютным значениям CPM (имп/мин) в сравнении с контрольными культурами без этанола (рис.2).
Рис. 2. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов, индуцированной митогенными лектинами PHA и Con A; ** – p<0,001; *** – p<0,0001 – статистически значимые отличия показателей культур с внесением митогенных лектинов PHA или ConA в присутствии этанола от показателей контрольных культур в отсутствии этанола; ↑ − тенденция к увеличению показателя; t-критерий Стьюдента
Дозы этанола 6×10-5–6×10-2 мг/мл не влияют на пролиферацию Т-лимфоцитов, индуцированную митогенным лектином PHA, в то же время усиливают пролиферацию Т-лимфоцитов, индуцированную Con A (рис. 2). Результаты, полученные в этом варианте исследований, свидетельствуют о том, что этанол обладает способностью усиливать пролиферацию CD8+ Т-лимфоцитов, поскольку известно, что Т-клеточный митоген Con A в культурах лимфоцитов in vitro стимулирует к пролиферации в основном популяцию CD8+-лимфоцитов [ М., К., 1998].
Таким образом, установлено, что этанол обладает способностью усиливать in vitro индуцированную митогенным лектином Con A пролиферацию CD8+ T-лимфоцитов, что говорит о тропности этанола к этим клеткам.
В экспериментах с предварительным культивированием лимфоцитов цельной крови здоровых лиц (в течение 3 часов при 37°С в атмосфере влажности с 5% СО2) в присутствии митогенов PHA или Con A и без них с последующим внесением этанола в конечных концентрациях 6×10-5–6×10-2 мг/мл (время культивирования 72 часа при тех же условиях), обнаружено, что этанол не оказывал влияния на фазу индуцибельного периода иммунного ответа и не усиливал последующую индукцию митогенными лектинами PHA или Con A деления Т-лимфоцитов (табл. 5).
Таблица 5.
Влияние этанола in vitro на фазу индуцибельного периода иммунного ответа лимфоцитов крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (M±σ)
Концентрация этанола мг/мл | Пролиферативный ответ лимфоцитов, (имп/мин) n=10 | ||
СП | PHA (5мг/мл) | Con A (5мг/мл) | |
контроль (без этанола) | 544±77 | 24593±4380 | 18483±4503 |
6×10-5 | 544±76,9 | 24508±4351 | 18457±4398 |
6×10-4 | 539±80,0 | 24393±4303 | 18450±4474 |
6×10-3 | 538±75,6 | 24829±4488 | 18275±4658 |
6×10-2 | 529±70,1 | 23726±4333 | 18647±4352 |
Таким образом, установлено, что этанол не влияет на индуцибельную фазу иммунного ответа.
1.2.Влияние этанола на активность NK-клеток
Исследовали in vitro влияние этанола на цитолитическую активность NK-клеток крови человека. Биологическим материалом для исследования служили лимфоциты, выделенные из венозной крови от 10 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя. На весь период культивирования (18 часов при 37°С в атмосфере влажности с 5% СО2) клеток-мишеней (клеточная линия К-562, меченая H3-уридином) и выделенных лимфоцитов в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях от 6×10-5–6 мг/мл Контролем служили соответствующие культуры клеток без этанола (рис. 3).
Рис. 3. Индекс цитолитической активности NK-клеток крови in vitro; * – p<0,05; ** – p<0,001; *** – p<0,0001 - статистически значимые отличия показателя в присутствии этанола от показателя контрольных культур в отсутствии этанола; ↓ − тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента
Установлено, что этанол в концентрациях от 6×10-5 до 6 мг/мл снижает цитолитическую активность NK-клеток. Наиболее выраженный эффект снижения наблюдается при дозах, которые вызывают слабое (6×10-2) и сильное (6×10-1 мг/мл) опьянение. Как видно из рисунка 3, при этих концентрациях отмечается высоко значимое снижение цитолитической активности NK-клеток по сравнению с контролем. Эффект полного подавления цитолитической активности NK-клеток этанолом наблюдается при концентрации 6 мг/мл, которая приводит к гибели человека.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
Основные порталы (построено редакторами)