Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекул CD25, CD38 и HLA–DR на лимфоцитах крови in vitro. Постановку реакции проводили в 24-луночных планшетах (“Nunc”, Denmark). В лунки вносили 500 мкл ППС и 500 мкл цельной крови, после чего вносили этанол в конечных концентрациях (6×10-5–6 мг/мл). Контролем служила кровь без этанола. Культуры инкубировали в течение 18 часов при 37° C в атмосфере влажности с 5% СО2. Обработку биологического материала проводили согласно протоколу фирмы “Becton Dickinson” (USA). Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA) с использованием двухцветных моноклональных антител фирмы “Becton Dickinson” (USA) [Loken M. R., 1990].
Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекулы HLA класса I на клетках крови in vitro. Постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных планшетах (“Nunc”), в которые вносили 100 мкл ППС c конечными концентрациями этанола 6×10-5–6×10-1 мг/мл и 100 мкл выделенных мононуклеаров (2×106 в 1 мл ППС), контролем служила клеточная суспензия в ППС без этанола. Культуры инкубировали 18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО2, после чего планшеты центрифугировали 5 минут при 300g, надосадок убирали стряхиванием планшета, добавляли 240 мкл раствора Хенкса. В пластиковые пробирки для проточной цитофлюориметрии (“Falcon”) вносили по 10 мкл суспензии клеток, добавляли по 50 мкл немеченого антитела к антигену HLA I класса («Сорбент», В.), встряхивали и инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Отмывали центрифугированием 5 минут при 300g, надосадок удаляли и добавляли 150 мкл раствора Хенкса, еще раз отмывали 5 минут при 300g, надосадок убирали. Добавляли 50 мкл вторичных антител (меченных ФИТЦ), инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Центрифугировали 5 минут при 300g, осадок фиксировали раствором Сell Fix. Клетки анализировали не позднее 24 часов после фиксации. Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA). Экспрессию молекул HLA I класса определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных клеток крови (моноцитов, T - и В-лимфоцитов, нейтрофилов и NK-клеток).
Метод изучения влияния этанола на функциональную активность фагоцитирующих клеток in vitro. В качестве источника фагоцитирующих клеток использовали венозную кровь, взятую в пробирки “Vacutainer” с ЭДТА. Постановку проводили в стерильных пробирках (“Nunc”) объемом 15 мл, в которые вносили по 500 мкл цельной крови. Затем вносили этанол в конечных концентрациях 6×10-5 – 6 мг/мл в эксперименте. Контролем служила кровь без этанола. Культуры инкубировали в течение 18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО2. Интенсивность реакции оценивалась количественно по числу импульсов за 1 минуту (имп/мин) в расчете на каждую исследуемую пробу. Для активации хемилюминесцентной реакции фагоцитирующих клеток использовали зимозан (“Sigma Chemical Co”, USA), опсонизированный по [ Ю., А., 2004], или раствор форбол-меристат-ацетата (ФМА). В пробирки (по 3 на пробу) добавляли по 15 мкл зимозана (10 мг/мл) или ФМА (0,2 мг/мл) и регистрировали уровень хемилюминесценции в течение 30 минут. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивали по максимальному значению на кинетической кривой хемилюминометра Люцифер Б (“Диалог”, Москва). Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяли по данным трех идентичных измерений. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови) : средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови).
Методы иммунологического обследования
Материалы для исследования. В качестве биологического материала для иммунологических исследований использовали репрезентативную выборку образцов периферической крови здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью спустя 17–19 часов после употребления последней дозы крепкого алкоголя.
Часть работы выполнена на базе ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России. В работе представлены результаты иммунологического обследования 220 больных алкогольной зависимостью, проходивших стационарное или амбулаторное лечение в наркологических клиниках и диспансерах города Москвы в период с 1994 по 2009 годы, а также от 180 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя
Распределение обследованных лиц по полу и возрасту представлено в табл. 1.
Таблица 1.
Распределение обследованных лиц по полу и возрасту, n=400
Гендерный состав | Средний возраст пациентов | % обследованных |
Мужчины, n=321 | 24–60 лет (45,5±8,8 лет) | 81 % |
Женщины, n=79 | 25–60 лет (40,9±9,8 лет) | 19% |
В табл. 2 представлена возрастная и гендерная характеристика обследованных групп больных алкоголизмом и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя.
Таблица 2. Характеристика групп обследованных больных с алкогольной зависимостью и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (M±σ)
Группы обследованных | мужчины | женщины | Средний возраст (лет) | Рост (см) | Вес (кг) |
1. Больные алкоголизмом I стадии n=79 | 58 (73%) | 21 (27%) | 43±10 | 165–190 | 64–110 |
2. Больные алкоголизмом II стадии n=72 | 60 (83%) | 12 (17%) | 43,3±9,6 | 167–189 | 63–105 |
3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, n=69 | 60 (87%) | 9 (13%) | 44,9±9,6 | 165–192 | 63–105 |
4. Здоровые лица (контроль), n=90 | 73 (81%) | 17 (19%) | 44±10 | 163–195 | 60–128 |
5. Здоровые добровольцы, получавшие нагрузку алкоголем, n=90 | 70 (78%) | 20 (22%) | 44,2±9,2 | 164–198 | 60–135 |
У больных алкоголизмом I стадии, вошедших в группу 1, злоупотребление алкоголем варьировало от 1 года до 3,5 лет, средняя длительность хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) составляла 2,3±0,8 лет. Значимых различий длительности заболеваний у мужчин и женщин не было выявлено. Состояние алкогольного абстинентного синдрома ни у одного из больных группы 1 не было отмечено. Толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,4 л до 0,8 л (в среднем 0,6±0,2 л) и у женщин от 0,3 л до 0,6 л (в среднем 0,43±0,1 л) крепких алкогольных напитков в сутки (табл.3). Больные употребляли крепкий алкоголь в течение 2−3 дней до исследования в количестве 0,3–0,45 литра, забор крови проводили спустя 17–19 часов после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения медикаментозного лечения.
Таблица 3.
Характеристика обследованных пациентов по длительности злоупотребления алкоголем, толерантности к алкоголю и частоте запоев, M±σ.
Группы пациентов | Длительность хронической интоксикации | Толерантность к крепкому алкоголю (в литрах) | Продолжитель-ность запоев (дни) | Частота запоев в год | |
мужчин | женщин | ||||
1. Больные алкоголизмом I стадии, n=79 | 2,3±0,8 | 0,6±0,2 | 0,43±0,1 | 0 | 0 |
2. Больные алкоголизмом II стадии, n=72 | 7,5±2,6 | 0,9±0,2 | 0,68±0,22 | 10 − 20 | 4 − 7 |
3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, n=69 | В анамнезе | 0 | 0 | ||
8,1±2,0 | 0,5 – 1,2 | 0,4 – 1,1 |
У больных алкоголизмом группы 2 длительность ХАИ варьировала от 6 до 10 лет (в среднем 7,5±2,6 лет). Алкогольный абстинентный синдром появился 4–6 лет назад. Частота появления ААС варьировала от 4 до 7 раз в год (табл. 3). Продолжительность запоев составляла 10–20 дней, толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,6 до 1,2 л (в среднем 0,9±0,2 л) и у женщин от 0,4 до 1 л (в среднем 0,68±0,22 л) крепких алкогольных напитков в сутки. Больные употребляли алкоголь в течение 1−2 дней до исследования в количестве 0,45–0,6 литра крепкого алкоголя, забор крови проводили спустя 17–19 часов после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения медикаментозного лечения.
В группу 3 вошли больные алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии длительностью от 3 до 5 лет, в среднем 4,1±1,1 лет (табл. 2, 3).
В контрольную, четвертую, группу сравнения (норма) вошли здоровые лица без синдрома зависимости от алкоголя. В группу 5 вошли здоровые добровольцы также без синдрома зависимости от алкоголя. В зависимости от дозы принимаемого алкоголя 5 группа добровольцев была разбита на 3 подгруппы (табл. 4). В подгруппу 1 вошли 27 практически не пьющих добровольцев, которые употребляли 50 мл водки или 150 мл красного вина за 17–19 часов до забора крови. В подгруппу 2 вошли 35 добровольцев, употреблявших раз в неделю по 0,2−0,3 л крепкого алкоголя. В течение дня они употребили 0,2−0,3 литра водки, последний был за 17−19 часов до забора крови. В подгруппу 3 вошли 28 добровольцев, эпизодически (раз в 1–2 месяца) употреблявших крепкий алкоголь, в течение 2–3 дней до исследования они употребили 0,6–1 литр крепкого алкоголя, последний приём был за 17–19 часов до забора крови. Перед данным исследованием добровольцы подгруппы 3 не употребляли никакого алкоголя в течение 1,5−2 месяцев.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
Основные порталы (построено редакторами)