Таблица 4.
Характеристика подгрупп обследованных здоровых добровольцев из группы 5, без синдрома зависимости от алкоголя
Подгруппы добровольцев | мужчины | женщины | Возраст | Рост | Вес |
1. 50мл водки или 150мл вина, n=27 | 20 (74%) | 7 (26%) | 24−60 лет | 164–188 см | 60–105 кг |
2. 0,2-0,3 л водки, n=35 | 30 (86%) | 5 (14%) | 25−60 лет | 170–190 см | 68–105 кг |
3. 0,6-1 л крепкого алкоголя в течение 2-3 дней, n=28 | 24 (86%) | 4 (14%) | 28−60 лет | 170–190 см | 70–135 кг |
Все обследованные (100%) – люди трудоспособного возраста с одинаковым социальным статусом (высшее образование, хорошая среда обитания и материальный достаток, проживание в полноценных семьях), жители города Москвы и ближнего Подмосковья. Из числа обследованных были исключены лица с отягощённой наследственностью по соматическим, аллергическим, аутоиммунным и онкологическим заболеваниям, а также страдающие туберкулезом, рецидивирующими герпетическими, цитомегаловирусными, хламидийными инфекциями, гепатитами B и C и ВИЧ-инфекцией.
Для всех больных и здоровых, принимавших участие в исследовании показателей иммунного статуса (400 человек), проводилось комплексное клиническое и лабораторно-инструментальное обследование, направленное на выявление сопутствующих патологий.
Исследование проводилось в соответствии с требованиями Основ законодательства «Об охране здоровья граждан». Врачами психиатрами-наркологами у больных и у здоровых добровольцев было получено информированное согласие на проведение обследования.
Всем добровольцам после нагрузки алкоголем и больным алкоголизмом проводили определение показателей иммунного статуса: клеточного и гуморального иммунитета.
Забор крови у здоровых проводили рано утром, а у больных в момент поступления в клинику или в наркологический диспансер в пробирки с гепарином, ЭДТА и сухие без антикоагулянта с помощью системы “Vacutainer” (“Becton Dickinson”, USA). Для оценки иммунного статуса кровь использовали не позднее 6-и часов после забора.
Методы определения клеточного иммунитета
Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки “Vacutainer“ с гепарином. В работе использовали мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови как указано выше [Boym A., 1968]. Клетки культивировали в полной питательной среде (ППС), как указано выше (методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro).
Всем обследованным проводили клинический анализ крови с обязательным определением лейкоцитарной формулы.
Метод определения пролиферативной активности T- и B- лимфоцитов. Пролиферативную активность T - и B- лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) с применением митогенных лектинов PHA (“Sigma”, USA), Con A (“Sigma”, USA), PWM (“Sigma”, USA) и LPS (“Sigma”, USA), которая рассматривается как экспериментальная модель пролиферативной экспансии клеток, происходящей под влиянием антигенов in vivo. Контролем служили культуры без добавления митогенных стимуляторов. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения метил-3Н1-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Радиоактивность образцов измеряли на β-счётчике “Wallac 1409 DSA” (Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (CPM) в расчете на каждую культуру клеток, каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражали в виде средних арифметических значений и индекса стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения CPM опытных культур : средние значения CPM контрольных культур [ В. и др., 1984].
Метод определения цитолитической активности NK-клеток. Цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro как описано выше (методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro). Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(1 – средние значения CPM в опытных : средние значения CPM в контрольных культурах) × 100% [ П. и др., 1985].
Метод определения популяционного состава лимфоцитов. Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки “Vacutainer” с ЭДТА. Обработку крови проводили согласно протоколу фирмы “Becton Dickinson” (USA). Популяционный и субпопуляционный состав периферической крови изучали методом проточной лазерной цитофлюориметрии на приборе FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA) с использованием двух - и трёхцветных моноклональных антител фирмы “Becton Dickinson” (USA) [Loken M. R., 1990].
Методы определения функциональной активности фагоцитов. В качестве источника фагоцитирующих клеток использовали венозную кровь, взятую в пробирки “Vacutainer” с ЭДТА. Кислородзависимую активность фагоцитирующих клеток оценивали методом хемилюминесценции как описано выше. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови) : средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови). Поглотительную активность фагоцитов оценивали на модели дрожжевых грибов, меченных ФИТЦ. Метод основан на способности фагоцитирующих клеток in vitro поглощать Candida albiсans, меченные ФИТЦ. Интенсивность фагоцитоза оценивали на проточном цитофлюориметре FACS Calibur фирмы “Becton Dickinson” (USA). Фагоцитарный индекс вычисляли как число грибов Candida albicans, поглощённых одним нейтрофилом [ В. и др., 2001; Saresella M., Spesiale D. et al., 1999].
Методы определения гуморального иммунитета
Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в сухие пробирки “Vacutainer” без антикоагулянта. Кровь оставляли для свёртывания на 1 час при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин при 400g (+4о С). Сыворотку аликвотировали в пробирки “Eppendorf” и хранили до анализа при –20о C не более месяца.
Метод определения содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов классов A, M, G и E). Количественное определение содержания IgA, IgM, IgG и общего IgE в сыворотке крови человека проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест систем фирмы “Sigma” (USA). Постановку проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра – ридера “Titertek Multiskan MCC/340” (“Labsystems”, Finland) при длине волны 492 nm [ 1987].
Методы определения в сыворотке крови активности комплемента CH50, содержания компонентов комплемента C1, C3 и C4. Гемолитическую активность комплемента (CH50) в сыворотке крови определяли методом 50% гемолиза эритроцитов барана (ЭБ). Постановку реакции осуществляли в триплетах. Контролем служила стандартная пулированная (более 30 образцов) сыворотка здоровых доноров. Качество гемолитической системы контролировали по установленному стандартному значению оптической плотности суспензии сенсибилизированных эритроцитов, инкубированных в лунках без добавления сыворотки. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра – ридера “Titertek Multiskan MCC/340” (“Labsystems”, Finland) при длине волны 690 nm. Активность комплемента выражали в условных единицах – CH50, рассчитанных с помощью специальной программы. За единицу активности принимали количество комплемента, выраженное в мл, вызывающее 50% гемолиз сенсибилизированных ЭБ [ А. и др., 2001]. Количественное определение содержания в сыворотке крови C1, C3 и C4 компонентов комплемента проводили методом твердофазного ИФА с применением тест систем (“Beckman Culture”, USA). Для определения были использованы наборы «IFA-С1», «IFA-С3» и «IFA-С4», основанные на «сэндвич» - варианте твердофазного ИФА. Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Учёт реакции проводили с помощью спектрофотометра – ридера “Titertek Multiskan MCC/340” (“Labsystems”, Finland) при длине волны 630 nm [Walport M. J., 2001].
Методы определения содержания в сыворотке крови С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Количественное определение содержания в сыворотке крови CRP, ASO и RF. Тест основан на взаимодействии исследуемых сывороток или контрольной сыворотки со специфическими моноклональными антителами к CRP, или ASO, или RF, иммобилизованными на латексных частицах. Появление отчетливо видимой агглютинации латекса в ячейках стеклянного слайда указывает на положительный результат теста. В работе были использованы наборы HUMATEX CRP, ASO и RF (“HUMAN”, Deutschland). Постановку реакции проводили согласно протоколу фирмы-изготовителя. Количественное определение содержания в сыворотке крови ЦИК. Определение основано на снижении растворимости иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Увеличение мутности раствора при осаждении циркулирующих иммунных комплексов ПЭГ определяли турбодиметрически, оценивая скорость нарастания оптической плотности. При 3% концентрации ПЭГ происходит осаждение крупных иммунных комплексов, при 4% концентрации ПЭГ – средних и мелких. Измерение проводили с помощью спектрофотометра – ридера “MRX Microplate Reader” (“Dinex Technology Ins.”, USA) при длине волны 340 nm. Конечный результат выражали как среднее арифметическое трех значений оптической плотности (OD) в минуту [Digeon M. et al., 1977].
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
Основные порталы (построено редакторами)