Постановка биологической пробы
В ряде случае для установления окончательного диагноза на инфекционную болезнь, а также при решении вопроса о снятии карантина или карантинных ограничений с хозяйства ставят биологические пробы. При постановке их с целью определения патогенности возбудителей используют чистые культуры бактерий, вирусов, грибов. Кроме того, применяют нативные суспензии и взвеси, приготовленные из различных органов и тканей больных или подозреваемых в заражении рыб.
Биопробы ставят в аквариумах, ваннах или бассейнах, создавая в них оптимальные условия для жизни рыб и размножения возбудителей. Наблюдения ведут ежедневно, учитывают число погибших рыб, клинические признаки болезни и характер патологоанатомических изменений. Продолжительность опытов устанавливают с учетом инкубационного периода и длительности течения заболевания в естественных условиях. В опыты отбирают восприимчивых к данному заболеванию рыб из благополучного хозяйства. В каждой серии для заражения и контроля берут по 10 рыб.
Для подтверждения бактериальной природы болезни испытывают чистые культуры. Здоровых рыб заражают 2-суточными бульонными культурами внутрибрюшинно или внутримышечно в дозах 0,1-0,2 мл. Молодые или старые культуры для биопробы непригодны, так как у них меняются вирулентные свойства. Музейные штаммы перед опытом пассируют через восприимчивых рыб.
Биологическая проба считается положительной, если у 80 % зараженных рыб проявляется комплекс клинических признаков и патологоанатомических изменений болезни и погибает не менее 50 % заболевших рыб при полном сохранении их в контроле, а также при выделении исходных возбудителей.
По окончании опытов воду в аквариумах обеззараживают, создавая в ней 4%-ную концентрацию формалина или 10%-ную концентрацию суспензии хлорной извести. Через 1 ч воду спускают в канализационную сеть, а рыб утилизируют. Весь инвентарь и посуду, бывшие в контакте с больной рыбой, дезинфицируют в 4%-ном растворе формальдегида в течение 1 ч.
При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах, земляных садках, карантинных прудах проводят дезинфекцию воды хлорированием, доводя содержание свободного хлора в воде до 4—5 мг/л. Через 24 ч воду пропускают через известковый фильтр (используя только свежую негашеную известь). После этого ложе прудов дезинфицируют негашеной (10 т/га) или хлорной известью (3 т/га) и оставляют без воды в течение 1 мес.
В случае если ставится вопрос о снятии карантина или других ограничений, биопробу проводят непосредственно в прудах хозяйства согласно инструкции по борьбе с соответствующим заболеванием.
Лабораторная работа №3
Тема: «Методы микологических исследований
При подозрении на грибковые заболевания рыб проводят микологические, а при бранхиомикозе и глубоких микозах — гистологические исследования.
При большинстве микозов рыб (бранхиомикоз, сапролегниоз и др.) достаточно надежным методом диагностики является микроскопическое исследование патологического материала. Исследуют нативные препараты из пораженных органов с добавлением нескольких капель 50%-ного водного раствора глицерина, 0,9%-ного раствора хлорида натрия или водопроводной воды.
При исследовании на бранхиомикоз микроскопируют некротизированные участки или подвергнутые гнилостному разложению жабры больных рыб. Соскобы с жабр помещают на предметное стекло, добавляют несколько капель воды или других растворов, раздавливают покровным стеклом и просматривают при малом и среднем увеличении. В поле зрения микроскопа хорошо видны гифы гриба со спорами. В гистологических срезах они располагаются в просвете сосудов и респираторных складках, окрашиваются гематоксилин-эозином в темно-лиловый цвет.
Для обнаружения сапролегниевых грибов исследуют под микроскопом соскобы с кожи, жабр, носовых ямок, а также икру. При этом хорошо видны гифы гриба, заканчивающиеся зооспорангиями.
При глубоких микозах (ихтиофонозе, экзофиаламикозе, микотическом грануломатозе) исследуют микроскопически нативные раздавленные препараты из пораженных органов (печени, почек, селезенки и др.).
Чистые культуры грибов выделяют на обычных грибных средах — агаре Сабуро, Чапека, МПА. Для выделения возбудителя бранхиомикоза посевы делают из жабр, подвергшихся гнилостному разложению. Возбудителей ихтиофоноза и других козов культивируют на МПА с добавлением 1 % сыворотки крупного рогатого скота, а также на глюкозо-дрожжевом агаре.
Сапролегниевые грибы хорошо растут на стерилизованных кипячением семенах конопли и льна, помещенных в агаровые пластины (1,5%-ный агар на воде), которые раскладывают в чашках Петри. Грибок растет при комнатной температуре в виде ватообразных колоний. Его также культивируют на МПА, агаре Чапека и Сабуро, для чего вырезают из них небольшие блоки, засевают культурой и раскладывают в чашки Петри.
Микологичесое исследование
Пробы для микологического исследования берут от только что погибших или больных рыб. В замороженном виде их можно хранить до 3 сут, а консервировать до 2 сут в растворе антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД на 1 мл раствора).
В лаборатории патологический материал исследуют под микроскопом, выделяют чистую культуру возбудителя, определяют его патогенность.
Микроскопируют мазки из различных очагов поражения. Исследуют без окрашивания в капле 0,9 %-ного раствора хлористого натрия или 50 %-ного водного раствора глицерина; Для установления видовой принадлежности гриба делают посевы (не менее 5) на питательные среды. Первичные посевы проводят на плотные' агаровые среды. Предположительно (по клиническим Признакам) определяют вид возбудителя, выбирают состав среды, так как некоторые возбудители микозов растут на средах с определенными ингредиентами.
В исследуемом материале могут присутствовать различные бактерии, плесени. Для получения чистых культур применяют методы разделения. Так, добавление 0,5 мг/мл 2 %-ного раствора актидиона задерживает рост плесневых грибов и практически не мешает развитию патогенных грибов. Снижение рН питательной среды до 3—4 не прекращает роста грибов, в то время как бактерии, особенно сапрофиты, могут развиваться только при рН 7,0—8,5. При температуре 5—10 °С большинство бактерий в отличие от грибов не растет.
При посеве на плотные питательные среды можно обнаружить отдельные колонии. Интересующую колонию осторожно переносят на новую питательную среду и получают рост одного вида микроорганизма.
При посевах для выделения возбудителя рыбу вскрывают, отдельными ножницами вырезают маленькие кусочки ткани из очага поражения, переносят во флаконы со стерильным раствором стрептомицина и пенициллина
(по 500 ЕД в 1 мл)'на 15—20 мин. Затем кусочки материала переносят на агар Чапека в чашки или пробирки.
Микроскопические исследования патологического материала" проводят в капле 0,9 %-ного раствора хлористого натрия, накрытой покровным 'стеклом, при опущенном конденсаторе или с прикрытой диафрагмой.
Хорошо сформировавшиеся колонии гриба на агаре пересевают на скошенный агар в пробирки.
По культуральным признакам колоний гриба на средах, при изучении; пол микроскопом мицелия, расположения спор определяют его вид.
Лабораторная работа №4
Тема: «Методы изучения протозойных болезней рыб. Сбор, фиксация, изучение морфологических особенностей, определение видовой принадлежности»
Клинический осмотр проводят выборочно непосредственно в водоеме, при контрольном отлове или посадке рыб в специальные емкости (аквариумы, садки, бассейны и т. п.). Рекомендуется просматривать не менее 100 рыб каждого вида и возраста. Регистрируют нарушение поведения рыб: пугливость, угнетение, возбуждение, координацию движения, равновесие в воде. Осматривают кожные покровы и плавники, обращая внимание на количество и качество слизи, изменение окраски. Приподнимая жаберные крышки, осматривают жабры. Обращают внимание на окраску, форму, рисунок и степень ослизнения жабр, структуру лепестков, просматривая их с помощью лупы.
Проводят учет больных рыб в абсолютном и процентном выражениях (заболеваемость). Рыб с клиническими признаками отсаживают в ведра или другие емкости и переносят в лабораторию, где проводят другие исследования.
Для исследования на наличие протозойных болезней берут 15-20 рыб из рыбоводной ёмкости, подозреваемых в неблагополучии. Просматривают 25 полей зрения микроскопа и подсчитывают среднее количество паразитов в одном поле зрения микроскопа при увеличении 7*8. Обнаружение 5-7 паразитов в одном поле зрения свидетельствует о заболевании и необходимости проведения лечебных мероприятий.
Уровень интенсивности инвазии, при котором отрицательное влияние простейших на рыбу минимально, принят за пограничный удельный индекс интенсивности (УИИ). Он определяется отношением средней интенсивности инвазии к средней массе рыбы и разделяет относительно безопасное паразитоносительство от опасных для рыб уровней инвазии.
Диагноз
Диагноз на инвазионные болезни ставят на основании клинических признаков и наличия паразитов при микроскопическом исследовании слизи, взятой с поверхности кожи и жабр, а также в мазках крови. Для обнаружения кровяных жгутиконосцев в неподсохших ещё мазках крови их лучше фиксировать и окрашивать по Паппенгейму. Затем мазок споласкивается водой и сушится.
Определение видовой принадлежности простейших
Для определения простейших — инфузорий — готовят мазки соскобов из жабр и кожных покровов на предметных стеклах, подсушивают их на воздухе и хранят в бумаге или фиксируют жидкостью Шаудина 15—20 мин. Мазки, фиксированные жидкостью Шаудина, затем окрашивают железным гематоксилином. Из цист миксоспоридий также готовят мазки на предметных стеклах, которые сразу заключают в глицерин-желатин. В дальнейшем определение паразитов ведут по таким препаратам без дополнительной обработки и окраски.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОСТЕЙШИХ - ПАРАЗИТОВ РЫБ
Простейшие - животные, большинство из которых состоят из одной клетки, функционирующей как целый организм. Наружную мембрану называют плазматической оболочкой (плазмалеммой). В цитоплазме располагаются эктоплазма — плотный, однородный, прозрачный, поверхностный слой, эндоплазма — жидкая, зернистая, неоднородная часть, различные органеллы, ядра и включения клетки. Самый поверхностный слой у некоторых групп простейших образует тонкую пленку - пелликулу, обуславливающую постоянную форму тела.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
