Лабораторная работа №1. Тема: «Методика по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб (стр. 9 )

полно выяснить фауну паразитов рыб, что совершенно необходимо для объективной оценки паразитологической ситуации в конкретном хозяйстве, водоеме.

Полному паразитологическому исследованию в изучаемом водоеме подвергают не менее 15 рыб каждого вида и возраста, личинок исследуют не менее 25 экз. в каждом случае. Для исследования необходимо брать живую или только что уснувшую рыбу и лишь в исключительных случаях зафиксированную.

Паразитологическое вскрытие ведут в принятом порядке и определенной последовательности, с тем чтобы тщательно и обстоятельно обследовать все органы и ткани рыбы, не упустить каких-либо паразитов. При вскрытии рыбы нужно соблюдать аккуратность, следить за тем, чтобы поверхность внутренних органов не была повреждена при выделении из полости тела, так как при небрежном вскрытии и повреждении органов паразиты могут быть утеряны или, попав в другой орган, могут ввести исследователя в заблуждение.

В паразитологическом исследовании используют компрессионный способ, т. е. исследуемую ткань или орган помещают между двумя стеклами, сдавливают между ними до прозрачности и исследуют в проходящем свете микроскопа или лупы.

Очень важно провести тщательный количественный учет найденных паразитов, ибо только таким образом можно оценить эпизоотологическую ситуацию и патогенное воздействие паразитов на рыб. Гельминтов и ракообразных учитывают в абсолютных величинах, а простейших принято подсчитывать в 25 полях зрения микроскопа при увеличении 7X10, 7X40 в зависимости от величины паразита и выражать в средней на одно поле зрения микроскопа.

Если количество паразитов так велико, что собрать всех не представляется возможным, то собирают часть их (например, моногеней с одной половины жаберных дут). Собранных паразитов отмывают в чистой воде и в дальнейшем изготовляют окрашенные препараты, по которым определяют видовую принадлежность. Для каждой группы паразите" существуют специфические способы фиксации и окраски, описанные в соответствующих лабораторных работах.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ:

1. Осмотр, внешнее обследование рыбы и взятие крови. Для обследования берут живую или только что уснувшую рыбу, обездвиживают ее и осматривают. Прежде всего, обращают внимание на окраску, форму тела, наличие на нем повреждений, опухолей, черных пятен, язв (при краснухе и других болезнях), белого налета на коже и жабрах, а также крупных паразитов—рачков, пиявок и др. После внешнего осмотра делают скальпелем соскоб с поверхности тела. Собранную слизь помещают в каплю воды на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала под малым, а затем под большим увеличением микроскопа. Здесь могут быть обнаружены простейшие: хилодонеллы, ихтиофтириусы, апиозомы, триходины, миксоспоридии, моногеней. После взятия соскоба рыбу следует быстро (чтобы не слишком подсушить) взвесить и измерить. Обычно определяют длину тела рыбы от переднего конца головы до конца чешуйчатого покрова, т. е. промысловую длину (7) и до конца хвостового плавника, т. е. зоологическую длину (L\ у сиговых рыб измеряют длину от конца головы до развилки хвостового плавника. Позднее, пользуясь этими данными, определяют те' л роста и коэффициент упитанности по формуле

где К—коэффициент упитанности; Р - масса рыбы, г; /—длина тела до конца чешуйчатого покрова, см.

Если возраст исследуемой рыбы не известен, то для его определения берут чешуйки под спинным плавником, у бесчешуйных рыб берут жесткий луч спинного или грудного плавников, по спилам которых определяют возраст. Иногда используют слуховые камешки (отолиты), определяя возраст но их шлифам. Далее у рыбы отрезают ножницами плавники и помещают их на стекла для вскрытия, смочив хорошо водой, прикрывают чашками Петри. Кровь для приготовления мазков и обнаружения кровеваразитов удобно брать либо из сердца, либо из хвостовой артерии.

Для приготовления мазка каплю крови из пастеровской пипетки выпускают на правый конец чистого предметного стекла. Другое стекло со шлифованным краем подводят к капле слева под острым углом. Когда капля растечется по краю стекла, его быстро двигают влево и кровь равномерно распределяется по стеклу. Мазок подсушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом в течение 5 мин или смесью равных частей этилового спирта и эфира в течение 20—30 мин. Позднее мазок окрашивают и просматривают под микроскопом (Х90) для обнаружения кровепаразитов.

После взятия крови вырезают сердце, разрезают его небольшими ножницами, выпускают кровь на большое стекло и просматривают под лупой и бинокуляром. В крови могут быть трематоды из рода Sanguinicola. Мышцы сердца просматривают компрессионным способом.

Далее осматривают плавники, отрезанные ранее и хранящиеся увлажненными. На плавниках могут быть обнаружены простейшие (хилодонеллы, триходины, моногеней, гиродактилюсы, дактилогирусы, рачки и др.).

После плавников обследуют жабры. Ножницами отрезают жаберные крышки, а затем осторожно перерезают с двух концов жаберные дуги. Вынимают их пинцетом и переносят на стекло для вскрытия, покрывают чашкой Петри, смочив водой. Сначала обследуют жаберную артерию, в который могут быть трематоды рода Sanguinicola и их яйца, затем под лупой обследуют дуги целиком, раздвигая жаберные лепестки препаровальными иглами, осматривая и жаберные тычинки на наличие крупных паразитов (Ergasilus, Sinergasiius, Achteres, Lemaeocera), цисты миксоспориции. Затем делают соскоб и просматривают его под микроскопом компрессионным способом, с помощью которого обнаруживают таких мелких паразитов. как хилодонеллы, триходины, апиозомы, ихтиофтириусы, миксоспоридии, моногеней, личинки трематод и др.

Далее обследуют носовые полости. Сначала с помощью пипетки капают в них чистую воду и тут же вместе со слизью оттягивают ее обратно. Такую процедуру делают 2—3 раза до полного извлечения слизи. Слизь просматривают под микроскопом компрессионным способом. Потом разрезают носовую полость и делают соскоб с ее внутренней стороны, который просматривают так же, как предыдущий. В носовых полостях могут быть обнаружены инфузории, никсоспоридии, моногенеи и представители других групп паразитов.

2. Вскрытие полости тела и обследование внутренних органов. Вскрытие делают очень осторожно, чтобы не повредить внутренних органов. Для вскрытия полости тела делают поперечный разрез несколько впереди анального отверстия, не повредив кишечника. В этот разрез вводят ножницы и делают продольный разрез вдоль брюшка, вплоть до жаберной полости, и отрезают левую стенку полости тела. Осматривают внутренние органы снаружи и приступают к вскрытию. Сначала выделяют кишечник и связанные с ним внутренние органы: печень, желчный пузырь, селезенку. Для этого тонкими ножницами аккуратно отрезают кишечник у ротовой полости и у самого анального отверстия, после чего осторожно вынимают весь комплекс внутренних органов, связанный с кишечником. Все это помещают в отдельную чашку Петри или кювету, где проводят дальнейшее вскрытие. Осторожно выделяют желчный пузырь, так как при его повреждении и излитии желчи могут быть потеряны находившиеся в нем паразиты. Далее из полости тела выделяют оставшиеся там внутренние органы: гонады, плавательный пузырь, почки, мочевой пузырь. Мочевой пузырь выделяют также очень осторожно, ибо он мал (огненно у карповых рыб) и легко может быть потерян. Чтобы его обнаружить, подводят конец небольшого пинцета под мочеточники и, слегка оттягивая их вверх, ведут пинцет по направлению к анальному отверстию: слияние мочеточников будет местоположением мочевого пузыря. Отпрепарированные органы помещают на стекла для вскрытия, в чашки Петри, кюветы, следя за тем, чтобы они постоянно были смочены водой и не соприкасались друг с другом. После препарирования всех внутренних органов осматривают брюшную полость, где могут встретиться личинки ленточных, круглых червей, трематоды и другие паразиты.

Далее исследуют все внутренние органы. Желчный и мочевой пузыри помещают на часовые стекла (каждый на отдельное стекло), разрезают острыми ножницами и их содержимое рассматривают под лупой и микроскопом (при малом и большом увеличении). С внутренней стороны стенки пузырей делают соскоб, который также просматривают под микроскопом. В желчном и мочевом пузырях

ленточных червей. Затем обследуют печень, селезенку, гонады, почки, жировую ткань. Сначала каждый орган осматривают невооруженным глазом, обращая внимание на его цвет, размер и форму. Затем отделяют по небольшому кусочку от каждого органа и просматривают под микроскопом (при малом и большом увеличении) для обнаружения спор миксоспоридии, не собранных в цисту и потому невидимых невооруженным глазом. Остальную часть органа просматривают компрессионным способом под МБС или лупой.

Кишечник разделяют на небольшие части и каждую часть разрезают вдоль. Крупные куски непереваренной пищи удаляют, внимательно осмотрев их, затем делают соскоб содержимого, а также соскоб со стенки кишечника, просматривают то и другое компрессионным способом под МБС при малом и большом увеличении микроскопа. В кишечнике могут быть найдены ооцисты кокцидий, жгутиконосцы, миксоспоридии, трематоды, цестоды и их личинки, круглые черви и их личинки, скребни.

Плавательный пузырь сначала осматривают внешне, а затем разрезают вдоль и делают соскоб с его внутренней поверхности и между оболочками, просматривая их под малым и большим увеличением микроскопа. Стенку пузыря просматривают компрессионным способом. В плавательном пузыре могут быть обнаружены ооцисты кокцидий, круглые черви, миксоспоридии, грибы и др.

Глазное яблоко аккуратно выделяют из глазницы, подрезая его снизу тонкими ножницами, и делают соскоб с дна глазного яблока. Вынутый глаз осторожно разрезают и выделяют хрусталик и стекловидное тело. Хрусталик просматривают под лупой или МБС, поворачивая его с помощью препаровальных игл. Если паразитов обнаруживают, хрусталик аккуратно сдавливают между двумя предметными стеклами: в отслоившейся оболочке четко видны метацеркарии трематод рода Diplostomum, миксоспоридии, круглые черви. Стекловидное тело просматривают компрессионным способом.

Далее обследуют головной и спинной мозг. Для этого вскрывают черепную коробку рыбы с помощью больших ножниц, скальпеля или другого инструмента в зависимости от величины рыбы. Выгнутый мозг просматривают компрессионным способом под МБС пси малом и большом увеличении микроскопа. Для выделения