, , ,  

Белки вируса гепатита С в клетках печени при остром гепатите С: связь  с повреждением печени и исходом заболевания

Институт вирусологии им. РАМН, Москва; Инфекционная клиническая больница №1, Москва; Московский НИИ онкологии им.

Гепатит С – широко распространенное заболевание, характеризующееся высокой частотой хронизации: у 70-80% больных, перенесших острый гепатит С (ОГС), формируется хронический гепатит С (ХГС) [7, 11]. Исследования гепатита С на клеточном и молекулярных уровнях посвящены главным образом хронической форме заболевания. Это связано с особенностями течения ВГС-инфекции: в большинстве случаев (70-80%) ОГС проходит бессимптомно или со скудной клинической симптоматикой [9, 11]. До настоящего времени не выявлены вирусные и хозяйские факторы, определяющие исход ОГС. Основным объектом исследования у пациентов с ОГС служит периферическая кровь (сыворотка и лимфоциты). Предполагают, что основную роль в клиренсе ВГС играет ранний, сильный и мультиспецифичный Т-клеточный иммунный ответ  [10, 17, 21]. Вопрос о клеточных и молекулярных механизмах, вовлеченных в репликацию вируса при ОГС в печени, исследован недостаточно. Участие вирусных белков в патологическом процессе изучалось либо у пациентов с терминальной стадией гепатита С после трансплантации печени, у которых в пересаженном органе развивается ОГС [3, 14], либо при экспериментальном заражении шимпанзе [12]. Данные об экспрессии белков ВГС в печени больных с естественным течением ОГС и их роли в патогенезе крайне ограничены [20]. Между тем, эти вопросы представляют значительный интерес: в исследованиях in vitro и на модели трансгенных мышей показано, что повышенное накопление вирусных белков влияет на метаболизм клеток и может вызывать патологические изменения, приводящие к их гибели [17]. В то же время, сведения о воздействии белков ВГС на клетки и организм противоречивы: вирусные белки могут супрессировать или усиливать иммунный ответ, ингибировать или индуцировать апоптоз [17, 18]. До сих пор не выявлены маркеры персистенции, не выяснена роль белков ВГС в определении исхода ОГС и в установлении хронической ВГС-инфекции. 

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Цель данной работы состояла в изучении экспрессии пяти вирусных белков в ткани печени больных ОГС и в анализе их связи с течением и исходом острого гепатита С.

Материалы и методы

Пациенты. В исследование было включено 20 пациентов с ОГС в возрасте от 19 до 55 лет (25,2±1,8 лет), поступивших в инфекционную клиническую больницу №1 г. Москвы в период с ноября 2001 г. по ноябрь 2003 г. Диагноз ОГС ставился на основании общепринятых эпидемиологических и клинико-лабораторных данных, а также исключения других этиологических факторов. У всех пациентов уровень аланинаминотрансферазы (АЛТ) превышал норму более чем в 10 раз (в среднем 1631±190 мкмоль. мин/л), активность ферментов аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы, γ-глутамилтранспептидазы (ГГТП)  и концентрация общего билирубина также были достоверно выше нормы у большинства пациентов. У 17 больных (85%) была зарегистрирована желтуха. Клиническая симптоматика была относительно скудной, наиболее частыми проявлениями были диспепсический и астенический синдромы. Пациенты поступали в стационар в среднем на 4,8±1 день желтухи, продолжительность клинических симптомов болезни к этому моменту составляла в среднем 14,2±3,5 дня. Наличие антител к белкам ВГС при первичном скрининге сывороток (тест-система "Organon", Голландия) было установлено у 19 пациентов, у одного больного сероконверсия зафиксирована при повторном анализе через 8 дней.

Морфологический анализ. Образцы ткани получали методом чрескожной пункционной биопсии печени (ПБП) иглой Менгини в среднем на 33,6 ± 3,8 день от начала заболевания после уменьшения желтухи и снижения уровня АЛТ по крайней мере до 300 мкмоль/мин. л. Проведение ПБП осуществлялось после информированного согласия пациентов. Морфологическую характеристику срезов ткани печени проводили по системе Metavir, согласно которой гистологическую активность (А) гепатита оценивали по сумме двух компонентов – ступенчатого некроза (PMN) и интралобулярного некроза (LN); A=PMN+LN [5]. В качестве отрицательных контролей использовали биопсии печени от 3 пациентов с хроническим гепатитом В (ХГВ).

       Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание. Для  выявления белков ВГС в клетках печени применяли моноклональные антитела (МКА) к белкам core, NS3, NS4А, NS4В и NS5, получение, свойства и эпитопная специфичность которых описаны ранее [1, 13]. ИГХ окрашивание криостатных срезов печени проводили с использованием  комплекса  биотин - стрептавидин - пероксидаза (Dako LSAB2 System, Дания) как описано ранее [2]. В качестве негативных контролей использовали МКА к белкам ВИЧ-1.

       Детекция РНК ВГС. Определение геномной РНК ВГС в сыворотках пациентов проводили с помощью "nested"-варианта ПЦР (RT-PCR) с использованием синтетических праймеров из 5'-нетранслируемого региона ВГС [15]. Генотип ВГС определяли с помощью праймеров, специфичных к региону core [16].

       Исход ОГС  учитывали в среднем через 13,6 ± 1,7 месяцев после манифестации ОГС в 1-3 временных точках. Критериями предполагаемой реконвалесценции считали нормализацию печеночных проб и отсутствие РНК в сыворотке крови. Хронизацию заболевания констатировали при выявлении РНК и/или повышении активности трансаминаз.

       Статистическая обработка результатов. Подсчет средних значений, стандартных ошибок и коэффициентов корреляции проводили с использованием компьютерной программы ”GraphPAD InStat v.1.12a” (Univ. of Washington, США). Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента, U-тесту Манн-Витнея,  критериям Фишера или χ2. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.

Результаты

       При оценке морфологических изменений в ткани печени у 8 (40%) пациентов были обнаружены повреждения, характерные для гепатита со слабовыраженной активностью (А1), у 7 (35%) - с умеренной активностью (А2) и у 5 (25%) – для тяжелого гепатита (А3). Наиболее характерные патоморфологические признаки включали гидропическую и жировую дистрофию гепатоцитов, их полиморфизм, внутридольковые фокусы некроза, инфильтрацию портальных трактов лимфогистиоцитарными элементами, часто с внедрением элементов инфильтрата в дольку. Проведение корреляционного анализа показало, что величина LN была положительно связана  с показателями АЛТ и АСТ в период максимального подъема уровня ферментов (r=0,51, p=0,02-0,03), а величина PMN – с коэффициентом Де Ритиса - отношением АСТ/АЛТ (r=0,63, p=0,003). Уровень билирубина, активность ГГТП и щелочной фосфатазы в острый период болезни, а также аминотрансфераз, соответствующих времени ПБП, не коррелировали с гистологической активностью гепатита (r<0,3).

Индивидуальные белки ВГС в печени были выявлены со следующей частотой: core и NS4A – 95%, NS3 – 90%,  NS4B и  NS5A – 89%; в целом хотя бы один из белков ВГС был обнаружен у всех (100%) пациентов. Число клеток печени, содержащих различные белки ВГС, варьировало у пациентов от единичных до 90%. Среднее количество антиген-позитивных (Aг+) клеток составляло 28% для белка core, 31% - для NS3, 35% - для NS4A и NS5A, 41% - для NS4B. При изучении окрашенных клеток в ткани печени было установлено, что антигены ВГС локализуются в цитоплазме гепатоцитов. Окрашивание носило диффузный характер, иногда в виде мелких гранул; для белка NS4B часто наблюдалось крупнозернистое окрашивание. У большинства больных ОГС прослеживалось более интенсивное окрашивание клеток у очагов лимфоидной инфильтрации (Рис.1а). Следует отметить, что инфицированные гепатоциты выглядели либо морфологически нормальными, либо имели те же морфологические изменения, что и неинфицированные. У 3-х больных наблюдалось цитоплазматическое окрашивание мононуклеарных клеток в печени, причем у одного пациента более 50%  лимфоцитов в инфильтратах были интенсивно окрашены МКА к белку NS4B. Все МКА были тестированы со срезами печени ВГС-негативных пациентов; результаты ИГХ  во всех случаях были отрицательными. МКА к ВИЧ не выявляли окрашенных клеток в печени пациентов с ОГС (Рис. 1б).

Генотипирование ВГС, проведенное у 15 больных, показало наличие субтипа 1b у 7 (47%), 1a – у 2 (13%), 2a – у 2 (13%) и 3a - у 4 пациентов (27%).

Для решения вопроса о том, существует ли связь между выявлением вирусных антигенов в печени и клиническими, биохимическими, морфологическими параметрами ОГС, был проведен корреляционный анализ. По количеству Аг+ клеток  пациенты были условно разделены на 2 группы. В 1-ую (12 человек) вошли больные с интенсивной ИГХ реакцией, у которых хотя бы один из исследованных белков выявлялся более чем в 50% клеток печени; во 2-ую – 8 больных, в печени которых было выявлено менее 30% окрашенных клеток (Табл. 1). Индивидуальные белки также выявлялись в 1-й группе в значительно большем числе клеток. При сравнении двух указанных групп были выявлены достоверные различия по ряду параметров. Такие показатели, как степень ступенчатого некроза и соотношение АСТ/АЛТ, были достоверно больше в 1 группе. Напротив, активность АЛТ на пике болезни была достоверно выше во 2 группе. Сравнение результатов выявления индивидуальных белков показало, что гистологическая активность гепатита прямо коррелировала с накоплением белка NS3 (Табл. 2). Степень PMN находилась в достоверной прямой связи с экспрессией белков core, NS3 и NS5A. Активность LN достоверно не коррелировала с накоплением белков ВГС. Статистически достоверных ассоциаций между выявлением белков и биохимическими показателями не обнаружено, но наблюдалась тенденция обратной зависимости между экспрессией белков ВГС и уровнем АЛТ и щелочной фосфатазы. Белок core в срезах печени обнаруживался тем чаще, чем меньше времени прошло от начала желтухи до ПБП (p<0,05). Выявлена связь между результатами детекции core-белка в печени и РНК ВГС в сыворотке в день проведения ПБП, но различия не достигали достоверных величин. В свою очередь, наличие РНК негативно коррелировало с биохимическими показателями и временем, прошедшим от начала желтухи, но не с гистологической активностью (Табл. 2).

Для исследования естественного течения и исходов ОГС проводился динамический контроль биохимических параметров и РНК ВГС в сыворотках крови больных. В первый срок (28,8±4,5 дней от начала болезни) РНК ВГС была выявлена у 12 пациентов (60%). К моменту проведения ПБП РНК определялась в сыворотках 8 пациентов (40%). В течение 2-го месяца у 8 из 16 исследованных больных выявлена циркуляция РНК ВГС, и еще у трех, несмотря на отсутствие РНК ВГС, уровень АЛТ был повышен до 2-10 норм. В сыворотках 10 пациентов, обследованных в течение 3-4-го месяцев после начала болезни, РНК ВГС была обнаружена у 6, но только у 3 больных отсутствие РНК сочеталось с нормализацией АЛТ. Об исходе ОГС можно было судить у 16 пациентов. На основании полученных данных у 3 пациентов (19%) предположили реконвалесценцию, у остальных (81%) - переход заболевания в хроническую форму.  При этом наблюдались разное течение ХГС: наличие РНК ВГС при постоянно нормальных значениях АЛТ или гиперферментемия с циркуляцией или без циркуляции РНК.

Для оценки факторов, которые могут влиять на исход ОГС, пациенты были разделены на две группы, отличающиеся по исходу болезни: одна группа - с биохимической и вирусологической ремиссией (предполагаемая реконвалесценция), вторая группа – со сформировавшимся ХГС (хронизация) (Табл. 1). Сравнение параметров показало, что первая группа характеризовалась достоверно более высоким уровнем экспрессии белков NS4A и NS3 ВГС в печени. Соre-белок выявлялся в первой группе также в большем числе клеток по сравнению со второй группой, но различия были статистически недостоверны. Накопление белков NS4B и NS5A не различалось в группах. РНК ВГС в первые два месяца от начала заболевания определялась в группах с равной частотой, тогда как сохранение виремии в период 3-4 месяцев достоверно чаще отмечалось у пациентов второй группы. В первой группе активность АЛТ в разгар болезни была ниже, но различия не достигали достоверных значений; среди этих пациентов преобладали больные с генотипом ВГС 1b. Остальные показатели (гистологическая активность, биохимические характеристики, пол, возраст, способ инфицирования) в обеих группах  не различались.

Обсуждение результатов

       Проведенные исследования показали, что при ОГС наблюдался высокий уровень экспрессии белков ВГС в печени: в биопсиях всех 20 пациентов обнаружены вирусные белки. Ранее при изучении образцов печени 69 пациентов с ХГС в нашей лаборатории было показано, что белки ВГС определялись у 74% больных [2]. Статистический анализ показал, что различия в выявлении белков ВГС в печени пациентов с ОГС и ХГС высоко достоверны (p=0,009). Важно отметить, что количество клеток печени, содержащих белки ВГС, при ОГС было больше, чем при ХГС: 51±7% против 33±3% (p=0,006). Эти различия складывались за счет достоверно большего числа больных ОГС, у которых хотя бы один из белков ВГС обнаруживался более чем в половине клеток печени (12 из 20, 60%), тогда как при ХГС таких больных было всего 16% [2]. Суммарная оценка белков ВГС в печени также показала, что белки ВГС выявлялись при ОГС чаще и в большем количестве клеток по сравнению с ХГС [20]. Анализ экспрессии отдельных белков ВГС в печени у больных с ОГС ранее не проводился. В настоящем исследовании индивидуальные вирусные белки в печени обнаруживались при ОГС с частотой 89-95%, при ХГС – 28-65% [2]. Сравнение этих показателей позволило установить, что различия характеризовались высокой достоверностью для белков core (p<0,00001), NS4A (p=0,0001) и NS3 (p=0,0007); достоверные различия показаны также для двух других изученных белков - NS5A (p=0,02) и NS4B (p=0,048). Полученные данные свидетельствуют о более высокой транскрипционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС.

Сравнение эффективности взаимодействия МКА с белками ВГС показало, что в инфицированных клетках печени одним из наиболее активно выявляемых белков был NS4B. Роль белка NS4B в репликации ВГС точно не установлена. В исследованиях in vitro показано, что белок NS4B индуцировал изменения в клеточных мембранах, в том числе образование «мембранных сетей» (membranous web) [8]. Остальные неструктурные белки, формирующие репликативный комплекс, впоследствие локализовались в этих участках. Возможно, ”мембраноформирующая” роль белка NS4B реализуется и при естественном инфекционном процессе. Полученные нами данные о высокой выявляемости этого белка как при острой, так и при хронической фазах гепатита С [2, 13] служат косвенным свидетельством в пользу этой гипотезы. Белок NS4A также был наиболее обильным у пациентов с ОГС. Этот белок является кофактором сериновой протеазы NS3, необходимой для протеолитического нарезания неструктурных белков [4]. Вероятно, более активная экспрессия NS4A при ОГС по сравнению с ХГС отражает повышенный уровень репликации вируса в острую фазу заболевания.

       Особый интерес представляют вопросы, связанные с участием вирусных белков в патогенезе гепатита С. В настоящей работе биопсии печени были проведены из этических соображений не на пике клинически выраженного заболевания, а при спаде активности ферментов (в среднем, через 1 месяц). Достоверной зависимости между выявлением суммарных белков ВГС в печени и длительностью заболевания не установлено. Впервые показано, что белок core достоверно чаще определялся в печени на более ранних стадиях заболевания (Табл.2). Сore оказался единственным из исследованных белков, экспрессия которого была прямо связана с циркуляцией РНК ВГС в крови. Эта связь указывает на то, что уровень экспрессии core-белка в клетках печени может определять эффективность сборки и/или высвобождения вирионов из гепатоцитов. Уменьшение накопления этого белка может отражать снижение репликативной активности ВГС с течением времени. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что у пациентов с ХГС накопление сore-белка, изученного с помощью тех же МКА,  коррелировало с обнаружением минус-цепей РНК ВГС в печени, характеризующих репликацию вирусного генома [2]. Таким образом, степень накопления сore-белка в печени может служить маркером ранней стадии ОГС.

Полученные данные свидетельствуют, что суммарная вирусная нагрузка (оцененная по белкам) в печени прямо коррелировала со степенью ступенчатого некроза (Табл.1). Результаты по исследованию биопсий посттрансплантационных пациентов также указывают на связь между повышением экспрессии вирусных белков с гистологическими повреждениями печени в период ОГС [3]. В настоящей работе впервые показано, что индивидуальные белки ВГС вносят разный вклад в патологические изменения печеночной ткани. В наибольшей степени с гистологической активностью (А) было ассоциировано накопление белка NS3 (Табл.2). При этом было установлено, что экспрессия белков ВГС ассоциирована только со степенью ступенчатого, но не интралобулярного некроза. Наибольший вклад в прогрессирование PMN вносили белки NS3, NS5A и core (Табл. 2). Эти результаты могут свидетельствовать о прямом цитопатическом действии ВГС. Ранее при изучении сore-белка в модельных системах было показано, что при избыточном накоплении он может оказывать прямое цитотоксическое действие [17, 18]. Получены также данные, указывающие на участие белков NS3 и NS5A в индукции патологических изменений клеток [17]. С другой стороны, выявленная связь между накоплением белков NS3, NS5A и core и некрозом клеток печени, а также топографическая ассоциация Аг+ клеток с лимфоидными инфильтратами позволяет предположить иммуноопосредованный характер повреждения гепатоцитов. При этом регионы, которые содержат эпитопы ВГС, взаимодействующие с МКА, могут являться основными мишенями иммунного распознавания.

Интересно, что степени ступенчатого и лобулярного некрозов по-разному соотносились с биохимическими показателями в разгар болезни. Выявленные прямые связи LN с уровнем трансаминаз, а PMN – с соотношением  АСТ/АЛТ, могут оказаться полезными для неинвазивной оценки гистологической активности ОГС.

Факторы, определяющие исход ОГС, до сих пор не выявлены. В нашем исследовании 3 пациента (19%), по-видимому, элиминировали ВГС. Сравнение групп с вероятной ремиссией и с хронизацией гепатита позволило установить достоверно большее накопление белков NS4A и NS3 ВГС в печени (Табл.1). Можно предположить, что для долговременного контроля за репликацией ВГС необходим высокий уровень экспрессии данных вирусных белков на ранних стадиях инфицирования, что способствует их более эффективной презентации иммунокомпетентным клеткам, активации T-лимфоцитов по Тh-1 типу и активной продукции гамма-интерферона и других провоспалительных цитокинов. Важно отметить, что при сходных клинико-лабораторных показателях  у предполагаемых реконвалесцентов наблюдались более низкие значения АЛТ во время манифестной стадии ОГС, что может указывать на раннее включение нецитолитического механизма подавления вирусной репликации у этих пациентов. Данные, полученные при изучении иммунного ответа у больных с саморазрешившимся ОГС и у экспериментально зараженных шимпанзе [19, 21, 22], также свидетельствуют о ведущей роли нецитолитического клиренса ВГС. Интересно, что среди реконвалесцентов чаще встречались пациенты с генотипом 1b, который ассоциируется с более высокой скоростью репликации и худшим прогнозом при ХГС по сравнению с другими генотипами [7, 11]. Это подтверждает данные о том, что высокий уровень виремии чаще сопряжен с ремиссией ОГС [6, 21]. В то же время, при исследовании пациентов с ХГС нами установлена прямая зависимость между суммарной вирусной нагрузкой (накоплением белков в печени при одновременном выявлении РНК ВГС в сыворотке) и активностью гепатита [2]. Полученные данные указывают на то, что одни и те же факторы, способствующие клиренсу ВГС при ОГС, могут усиливать повреждение печени при ХГС. С этим выводом согласуются данные, полученные при изучении вирус-специфического Т-клеточного ответа у пациентов с ОГС и ХГС [7, 17]. Следует отметить, что выявленное в ходе настоящего исследования инфицирование лимфоидных клеток в печени, по-видимому, также вносит определенный вклад в персистенцию ВГС.

Таким образом, проведенные исследования с использованием МКА, направленных к пяти белкам ВГС, продемонстрировали более интенсивное накопление белков ВГС в печени при ОГС по сравнению с ХГС и выявили значительные различия между пациентами по количеству и распределению индивидуальных вирусных белков. Сопоставление результатов иммуногистохимического выявления белков в печени in situ с биохимическими, клиническими и морфологическими данными впервые позволило получить прямые данные о роли белков ВГС в патогенезе ОГС и исходе заболевания: 1 - показана прямая зависимость между выявлением белков core, NS3 и NS5A и повреждением ткани печени; 2 - установлено, что накопление сore-белка в печени может служить маркером ранних стадий ОГС; 3 - установлено, что предполагаемая реконвалесценция ассоциирована с более интенсивным выявлением белков NS4A и NS3 в печени в ранние сроки после манифестации ОГС. Выявленные белки, связанные с клиренсом ОГС, могут быть перспективным компонентом вакцин против гепатита С.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ, грант 04-04-48409

В работе принимали участие:  ,  ,  , 


,  ,  ,  , 


,  ,  ,  ,   



Переписку вести с Масаловой Ольгой Владимировной. Адрес: 123098 Москва, НИИ вирусологии РАМН. Тел. сл.: 190-30-46; тел. дом: 912-69-12. Факс: (095)190-28-67